Escherichia coli blee
Judith Chiquinquira Castro Vargas1, Carla Andreina Lossada González2, Lenin Andrés González Paz1, Lorena Beatriz Atencio de Guínez1
1Laboratorio de Genética y Biología Molecular, 2Laboratorio de Citogenética, Departamento de Biología, Facultad Experimental de Ciencias, Universidad del Zulia, Maracaibo, estado Zu- lia. jchcvdu@gmail.com; lgonzalezpaz@gmail.com
Resumen
Las betalactamasas de espectro extendido (BLEE) representan un problema de sa- lud pública, las BLEE clásicas derivan de betalactamasas con actividad penicilinasa e inhibibles por ácido clavulánico. Por lo que se buscó determinar los perfiles de sus- ceptibilidad a antibióticos de cepas Escherichia coli aisladas de urocultivos, así como la presencia de los genes de resistencia blaTEM y blaSHV asociados al fenotipo BLEE.
Se procesaron 287 muestras a las cuales se les realizaron las pruebas bioquímicas
convencionales y la susceptibilidad a los antibióticos se llevó a cabo mediante las re-
comendaciones del CLSI. Se realizó la extracción de ADN mediante el protocolo de
lisis alcalina para la amplificación por PCR de los genes confirmatorios de la especie,
y los de los genes de resistencia blaTEM y blaSHV asociados al fenotipo BLEE. El 7% de las muestras resultaron positivas para E. coli de las cuales 5 fueron productoras de BLEE (24%). En todas las cepas se observaron bandas plasmídicas, encontrando de 1 a 3 bandas cuyos tamaños oscilaron entre 3 y 23kpb. El gen blaSHV fue el más fre- cuente (100%), mientras que el gen blaTEM fue menos prevalente (20%). Se recomien- da realizar estudios en diferentes grupos poblacionales para determinar el flujo de genes asociados al fenotipo BLEE en E. coli y otros patógenos de interés clínico. Se debe educar al personal médico acerca de este tipo de mecanismos de resistencia y las implicaciones que tiene el uso irracional de antibióticos sobre la diseminación y el problema que representan a nivel de salud pública nacional.
Palabras clave: Escherichia coli, betalactamasas de espectro extendido, urocultivos,
gen blaTEM, gen blaSHV.
Recibido: 04-03-2017 Aceptado: 31-10-2017
Abstract
Extended-spectrum betalactamases (ESBL) represent a public health problem, classical ESBLs are derived from betalactamases with penicillinase activity and in- hibitory to clavulanic acid. The aim of this study was to determine the antibiotic susceptibility profiles of Escherichia coli strains isolated from urine cultures, as well as the presence of blaTEM and blaSHV resistance genes associated with the phenoty-
pe ESBL. 287 samples were submitted to standard biochemical tests and suscepti-
bility to antibiotics was performed using CLSI recommendations. DNA extraction
was performed by the alkaline lysis protocol for PCR amplification of the species
confirmatory genes and of the blaTEM and blaSHV resistance genes associated with the ESBL phenotype. 7% of the samples were positive for E. coli of which 5 were ESBL producers (24%). In all strains plasmid bands were observed, finding from 1 to 3 bands whose sizes oscillated between 3 and 23 kbp. The blaSHV gene was the most frequent (100%), while the blaTEM gene was less prevalent (20%). Studies are recom- mended in different population groups to determine the flow of genes associated with the ESBL phenotype in E. coli and other pathogens of clinical interest. Medical staff should be educated about these types of resistance mechanisms and the im- plications of the irrational use of antibiotics on dissemination and the problem they represent at the national public health level.
Key words: Escherichia coli, extended-spectrum betalactamases, urocultures, gene
blaTEM, gene blaSHV.
Escherichia coli es un bacilo gram negativo, anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae, coloniza el intestino del hombre pocas horas después del na- cimiento y se considera microbiota normal, pero hay descritos varios grupos de
E. coli productora de diarrea. La bacteria se puede aislar e identificar tradicional- mente con base en sus características bioquímicas o serológicas, pero también se pueden estudiar sus mecanismos de patogenicidad mediante ensayos en cultivos celulares o modelos animales y, más recientemente, empleando técnicas de biolo- gía molecular que evidencian la presencia de genes involucrados en dichos meca- nismos (UK Standards for Microbiology Investigations, 2015).
Las infecciones por E. coli productoras de betalactamasas de Espectro Exten- dido (BLEE) han experimentado importantes cambios epidemiológicos en los úl- timos tiempos, la resistencia adquirida por las bacterias frente a los antibióticos, antisépticos y desinfectantes en la actualidad representa un problema de salud
pública, ya que desde el descubrimiento de los primeros antibióticos los microor- ganismos han sido capaces de evadir su acción (Rodríguez et al. 2015).
La mayoría de cepas BLEE encontradas son del tipo TEM o SHV, siendo las prin- cipales BLEE identificadas en enterobacterias como E. coli las que pertenecen a la clase molecular A grupo 2be (Esteve et al. 2015).
Es por eso, que son consideradas marcadores clínicos importantes y el conoci- miento de su incidencia juega un papel importante en la selección del tratamien- to apropiado. Los genes codificantes de enzimas tipo BLEE se han detectado en diversas regiones a nivel mundial, y el éxito de su diseminación está relacionado con la ubicación de los genes (blaSHV, blaTEM, blaCTX-M, entre otros) en plásmidos auto transferibles o móviles, los cuales pueden co-transferir a cepas de la misma espe-
cie o especies diferentes, resistencia a otros antimicrobianos, aspecto que compli- ca la terapia de algunas infecciones causadas por bacterias productoras de BLEE (Guzmán et al. 2013).
En tal sentido, el objetivo de esta investigación es determinar los perfi- les de susceptibilidad a antibióticos de cepas E. coli asiladas de urocultivos, así como la presencia de genes de resistencia como el blaTEM y blaSHV, quienes están implicados en la producción de infecciones nosocomiales, capaces de causar muertes intrahospitalarias.
Se evaluaron 287 muestras provenientes de urocultivos de pacientes de los di- ferentes servicios de un hospital público del estado Zulia, durante el período di- ciembre 2013 – marzo 2014. La muestra de orina fue colectada por el paciente, en un envase colector plástico estéril, el cual se mantuvo en frío no más de 2 h, el envase se rotuló con el nombre y apellido del paciente, edad, servicio de pro- cedencia e historial clínico, asimismo, se le preguntó si había recibido terapia an- tibiótica. Fueron procesados según la técnica del asa calibrada (Paz et al. 2012). A partir de un crecimiento axénico se realizaron las pruebas para la identificación del género y la especie, empleando las siguientes pruebas bioquímicas: prueba de la oxidasa, fermentación de azúcares, utilización del citrato, producción de enzima ureasa, motilidad, producción de indol, descarboxilación de la ornitina, arginina y de la lisina. Todas las pruebas se leyeron a partir de las 18 h de incubación a 35º C (Murray et al. 2015).
Se llevó a cabo utilizando el método de difusión en disco (Baüer et al. 1966). La concentración celular del inóculo de cada cepa bacteriana se preparó en solución salina al 0,9 % o caldo a partir de un cultivo previo (35±2º C por 18-24 h de incu- bación) con una turbidez equivalente al estándar 0,5 de McFarland (documento M100-S23 CLSI, 2016). Se inoculó la cepa por hisopado (en tres direcciones), en placas de Petri con agar Müeller-Hington (HiMedia Laboratories®). Luego se co- locaron asépticamente con una pinza estéril los siguientes discos de antibióticos: ampicilina (AMP) (10 μg), amoxicilina/ácido clavulánico (AMC) 20/10 μg, cefaloti- na (CF) 30 μg, cefotaxima (CTX) 30 μg, ceftazidima (CAZ) 30 μg, cefepima (FEP) 30 μg, aztreonam (ATM) 30 μg, meropenem (MEM) 10 μg, imipenem (IPM) 10 μg todos manufacturados por Dispens-O-DiscTM susceptibility system tomando en consideración las plantillas sugeridas por el Instituto Nacional de Higiene “Rafael Rangel” para el antibiograma estandarizado. Se incubaron a 35±2º C por 18 h en aerobiosis (CLSI, 2016).
La presencia de BLEE se determinó fenotípicamente mediante el método del doble disco mediante la observación de una distorsión en el halo de inhibición en- tre los discos de cefotaxima (CTX) 30 μg o ceftazidima (CAZ) 30 μg y cada uno de ellos con ácido clavulánico. Se empleó para esta prueba la cepa control K. pneumo- niae 70300 positiva para el perfil de resistencia BLEE (CLSI, 2016).
blaTEM, blaSHV
Se requirió la extracción de ADN total, para ello las cepas fueron crecidas en medio TSB (BD Tryptic Soy Broth) enriquecido con 1 % de glucosa con la finalidad de obtener la mayor cantidad de biomasa. Fueron inoculados 20 µL del cultivo bac- teriano, en tubos con 5 mL de caldo TSB + 1 % de glucosa, incubándolas posterior- mente 24 h a 35±2º C. Estos cultivos posteriormente fueron centrifugados a 7.000 g, se descartó el sobrenadante y el pellet obtenido fue resuspendido utilizando 500 µL de buffer TE. Seguidamente se realizó una centrifugación a 7.000 g y se descartó el sobrenadante, este paso de lavado con TE fue repetido tres veces. Una vez culminado el procedimiento de lavado, el pellet fue resuspendido en 200 µL de agua desionizada estéril y llevado a un baño de agua en ebullición durante 17 min, con la finalidad de producir lisis celular. Posteriormente a la ebullición, el micro- tubo se dejó reposar unos minutos hasta alcanzar temperatura ambiente y luego se procedió a centrifugar nuevamente a 7.000 g durante 5 min. El sobrenadante obtenido de esta centrifugación fue decantado a un nuevo microtubo estéril y al- macenado a -4° C para su posterior uso en las reacciones de PCR (Rivera 2009).
Todas las reacciones de estandarización de la PCR para la amplificación del gen uspA se llevaron a cabo en un volumen total de 25 µL conteniendo: Buffer para polimerasa + MgCl2 (1X); dinucleótidos trifosfatos (0.2 µM) y Taq polimerasa (5 U/ uL) (Martineau et al. 2000; Ausbel et al. 2002). La estandarización estuvo centrada en la variación de la concentración de los cebadores (0,2 µM y 1 µM, ver secuencias en tabla 2) vs la cantidad óptima del ADN extraído de las cepas en estudio: 0,5 µL
del ADN total extraído sin diluir, 0,5 µL de una dilución 1:10 o 2,5 µL de esta misma dilución del ADN (Tabla 1). Los reactivos de la PCR utilizados fueron manufactura- dos por la casa comercial Thermo Fisher Scientific Inc., mientras que los cebadores fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc. A partir de la estandari- zación se realizaron las amplificaciones de los genes señalados en la tabla 2.
ADN Primers | 0,5µL de ADN Total | 0,5µL dilución 10-1 de ADN Total | 2,5µL dilución 10-1 de ADN Total |
0,2µM | Rx1 | Rx2 | Rx3 |
1µM | Rx4 | Rx5 | Rx6 |
Fuente: Fernández (2010).
Luego de la estandarización de la reacción de la PCR para el gen uspA, el pro- tocolo fue aplicado a todas las cepas en estudio para confirmar molecularmente la identificación taxonómica bacteriana. En este sentido, la obtención de un ampli- cón mayor a 700 kbp. (Tabla 2) fue el criterio de confirmación de E. coli, como lo señala Clausen (2012).
Genes | Secuencia del cebador | Tamaño del amplicón (kpb) | Temperatura | Referencia |
uspA-F uspA-R | 5’-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3’ 5’-ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3’ | >700 | 58°C 60°C | Chen y Grif- fiths, (1998) |
blaCTX-F blaCTX-R | 5`-TTAATGATGACTCAGAGCATTC-3` 5`-GATACCTCGCTCCATTTATTG-3` | 901 | 44°C 60°C | Randriani- rina et al. (2009) |
blaTEM-F blaTEM-R | 5’-ATAAAATTCTTGAAGACGAAA-3’ 5’-GACAGTTAGCAATGCTTAATCA-3’ | 867 | 52°C 60°C | Gil et al. (2014) |
blaSHV-F blaSHV-R | 5’-ATGCGTTATATTGGCCTGTG-3’ 5’-AGCGTTGCCAGTGCTCGATG-3’ | 862 | 58°C 64°C | Mubarak et al. (2011) |
La amplificación fue llevada a cabo en un termociclador Applied Biosystem Mo- delo PCR 2720, las condiciones generales consistieron en una desnaturalización inicial a 94° C por 5 min seguido de 35 ciclos a 94° C por 2 min, y una extensión final a 72° C por 10 min. Las condiciones de alineamiento fueron 55° C por 1 min para el gen uspA, 58° C por 30 seg para los genes blaSHV y blaTEM, y 58° C por 30 seg para blaCTX. La separación y observación de los productos de PCR se realizaron según especificaciones de Ausbel et al. (2002) por electroforesis en gel de agarosa al 1,5
%p/v, en una cámara horizontal con buffer TBE sometida a 103 voltios (95±2 miliam- perios) durante 1h. Finalizada la corrida, los geles fueron observados en presencia de luz U.V sobre un transiluminador UVP Chromato – VUE modelo TM-36 de 115 voltios, 60Hz y capacidad de 1,2 amperios, y fotografiado con una cámara digital (Easy Share, Kodak). El tamaño de los productos de PCR se determinó según sus migraciones en los geles de agarosa y comparadas con la migración de las bandas de ADN estándar del marcador de peso molecular λ/HindIII (Promega®, EUA).
Se utilizó estadística descriptiva para determinar los porcentajes de cepas posi- tivas para la presencia de los genes de interés. La prueba de chi-cuadrado fue apli- cada para determinar diferencias y asociación entre el tipo de cepa y la presencia de los genes. Se hizo una comparación de media de las pruebas de susceptibilidad de cada cepa mediante el T-students, con un nivel de confianza del 99 %. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo en el programa Statgraphics plus versión
5.1. Los resultados se presentaron además en gráficos porcentuales y tablas de pa- trones de susceptibilidad. Realizando la discusión y resultados correspondientes, utilizando Microsoft Excel, office 2010.
Se demostró la presencia de E. coli. A través de las pruebas bioquímicas conven- cionales (oxidasa, fermentación de azúcares, utilización del citrato, producción de enzima ureasa, motilidad, producción de indol, descarboxilación de la ornitina, ar- ginina y de la lisina), (ver Figura 3) indicaron que de 287 un total de 21 muestras resultaron positivas para E. coli que represento el 7 % (Figura 1).
Figura 1. Cepas E. coli Positivas, representación porcentual.
Los resultados obtenidos en esta investigación demuestran la presencia de ce- pas E. coli confirmadas en muestras de origen clínico provenientes de pacientes de un hospital público del estado Zulia, durante el período diciembre 2013 – marzo 2014. La infección del tracto urinario es una importante causa de sepsis nosoco- mial y la segunda en la consulta de asistencia médica comunitaria. E. coli constituye el principal microorganismo aislado (Khan et al. 2013). En su mayoría los investiga- dores concuerdan en sus estudios que E. coli es uno de los principales patógeno aislados (Khan et al. 2013; Rodríguez et al. 2013; Hernández et al. 2014).
El 100 % de cepas de E. coli aisladas fueron resistentes a AMP y 24 % a AMC, en cuanto a la resistencia a cefalosporinas probadas contra los aislados señalados, se halló que las cepas fueron resistentes a: AZT (48 %), CAZ (43 %), FEP (38 %), CF (33
%) y CTX (33 %). De las cepas aisladas, el 48 % presentaron resistencia al ATM, no se encontró resistencia a los carbapenémicos MEM e IMP. El 100 % (Tabla 3 y Figura 2). Los fenotipos de susceptibilidad a antimicrobianos en las cepas señaladas en la ta- bla 1 mostraron 8 tipos de patrones diferentes siendo los más frecuentes N=1,2 y 5.
N Cepas Origen Patrón de susceptibilidad
1 60
2 117
3 260
4 283
5 6
6 21
7 193
8 201
9 17
10 35
11 119
12 43
13 197
14 115
15 121
16 191
17 270
CE UBD OBST UCI
CE CE UBD CE
CE CE CE
OBST MI
MI UCI MI UCI
AMPR-AMCS-CFS- CTXS-CAZS-FEPS-ATMR-MEMS-IPMS AMPR-AMCS-CFS- CTXS-CAZS-FEPS-ATMR-MEMS-IPMS
AMPR-AMCS-CFS- CTXS-CAZS-FEPS-ATMR-MEMS-IPMS 1
AMPR-AMCS-CFS- CTXS-CAZS-FEPS-ATMR-MEMS-IPMS
AMPR-AMCS-CFS-CTXS-CAZR-FEPS-ATMS-MEMS-IPMS AMPR-AMCS-CFS-CTXS-CAZR-FEPS-ATMS-MEMS-IPMS
AMPR-AMCS-CFS-CTXS-CAZR-FEPS-ATMS-MEMS-IPMS 2
AMPR-AMCS-CFS-CTXS-CAZR-FEPS-ATMS-MEMS-IPMS
AMPR-AMCS-CFS-CTXS-CAZS-FEPR-ATMS-MEMS-IPMS
AMPR-AMCS-CFS-CTXS-CAZS-FEPR-ATMS-MEMS-IPMS 3
AMPR-AMCS-CFS-CTXS-CAZS-FEPR-ATMS-MEMS-IPMS
AMPR-AMCS-CFS-CTXR-CAZS-FEPS-ATMS-MEMS-IPMS
AMPR-AMCS-CFS-CTXR-CAZS-FEPS-ATMS-MEMS-IPMS 4
AMPR-AMCR-CFR-CTXR-CAZR-FEPR-ATMR-MEMS-IPMS AMPR-AMCR-CFR-CTXR-CAZR-FEPR-ATMR-MEMS-IPMS
AMPR-AMCR-CFR-CTXR-CAZR-FEPR-ATMR-MEMS-IPMS 5
AMPR-AMCR-CFR-CTXR-CAZR-FEPR-ATMR-MEMS-IPMS
286 MI
AMPR-AMCR-CFR-CTXR-CAZR-FEPR-ATMR-MEMS-IPMS
30 CE AMPR-AMCS-CFR-CTXS-CAZS-FEPS-ATMR-MEMS-IPMS 6
145 MI AMPR-AMCS-CFS-CTXS-CAZS-FEPS-ATMS-MEMS-IPMS 7
210 UCI AMPR-AMCS-CFS-CTXS-CAZS-FEPR-ATMR-MEMS-IPMS 8
Abreviaturas: Ampicilina 10 µg (AMP); Amoxicilina/Ácido Clavulánico 20/10 µg (AMC); Cefalotina 30
µg (CF); Cefoxitina 30 µg; (CTX); Ceftazidima 30 µg (CAZ); Cefepima 30 µg (FEP); Aztreonam 30 µg
(ATM); Meropenem 10 µg (MEM); Imipenem 10 µg (IPM); Unidad de cuidados intensivos (UCI); Me-
dicina Interna (MI); Consulta Externa (CE); Obstetricia (OBST); Unidad Bolivariana de Diálisis (UBD);
Resistente (R); Susceptible (S).
Con respecto a la resistencia a penicilinas halladas en este estudio (Tabla 3) con un 100 % a AMP y 24 % a AMC, según la literatura, los datos obtenidos concuerdan con varios autores quienes señalan que se ubica por encima del 50 % (Khan et al. 2013; Rodríguez et al. 2013) e incluso en algunos casos hasta casi el 100 % (Hackman et al. 2013; Malhotra et al. 2016).
Además de esto, el patrón de multirresistencia a cefalosporinas se ha obser- vado en diversos estudios, además los autores refieren que su utilización sigue siendo recomendada sugiriendo que deben adaptarse las modalidades de admi- nistración de acuerdo al blanco farmacológico (Rodríguez et al. 2013; Suárez 2015). Por otro lado, se han encontrado diferencias entre los porcentajes de resistencia a los monobactámicos con valores más bajos a los presentados por este estudio que han sido reportados por McWilliams et al. (2014) y Villalobos et al. (2014), quienes
encontraron 10 % y 25 % de resistencia respectivamente en muestras de aislados clínicos. Mientras que valores de susceptibilidad a carbapenemicos al igual que en este estudio, ha sido documentada por muchos autores para E. coli en aislados clínicos de pacientes con ITU (Khan et al. 2013; Rodríguez et al. 2013; Hernández et al. 2014; Suárez 2015).
Por su parte, la aparición de cepas de E. coli BLEE ha ido en aumento en los últimos años a nivel mundial, sin embargo, valores por debajo de los encontrados (Tabla 3) en esta investigación han sido reportados en Suecia con frecuencias que oscilan entre 0,2 - 2,5 % (Helldal et al. 2013), en Estados Unidos con 3,9 % (Doi et al. 2013) y en España reportes de 3,9- 8,7 % (Rodríguez et al. 2013). En otros países la presencia de estas cepas es más alta, por ejemplo, en la India 21,4 % (Datta et al. 2014); y Colombia 54 % (Blanco et al. 2016) mientras que en otro estudio en Maracaibo, donde se analizaron un total de 3.883 cepas bacterianas de muestras clínicas, pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, de las cuales 1.761 de ellas fueron cepas de E. coli 45,35 % (Perozo et al. 2009).
Se realizaron seis reacciones con un volumen final de 25 µL, las cuales presen- taban variaciones en las concentraciones de ADN y de los primers. Los resultados arrojados para la estandarización reflejan que de acuerdo a las reacciones reali- zadas en base a la Tabla 1 la reacción adecuada fue la Rx3 (Tabla 4 y Figura 2), la cual permitió una visualización más nítida del gel de agarosa para ello se utilizaron las concentraciones propuestas por Martineau et al. (2000). Por cada reacción se tomaron 2,5 µL de Buffer más MgCl2 (1x), 0,25 µL de Taq polimerasa (5 U/µL), 2 µL
de la mezcla de di-nucleótidos trifosfato (0.2µM), 0,5 µL de cada primer –R 1 µM,
0,5 µL de cada primer –F (1 µM) más un volumen de 2.5 µL de ADN x 10-1 con agua
desionizada libre de ADNsas y ARNsas hasta llegar a un volumen total de 25 µL.
Reactivo | Volumen/Concentración | |
Buffer +MgCl2 | 2,5 uL | 1X |
DNTP Mix | 2 uL | 0.2 uM |
Primer-uspA-F | 0,5 uL | 1 uM |
Primer- uspA-R | 0,5 uL | 1 uM |
Taq polimerasa | 0,25 uL | 5 U/uL |
ADN | 2,5 uL | Dilución 1:10 en H2O libre de ADNsas y ARNsas |
H2O desionizada | 16,75 uL | |
Volumen final: | 25 uL | |
Figura 2. Estandarización de PCR del Gen uspA de la cepa control Escherichia coli ATCC®25922. Abreviaturas: MP, marcador de peso molecular; carril 1, reacción sin ADN; carril 2-7, reacciones con variaciones en las concentraciones de primer y de
ADN utilizados (Fuente: propia).
El carril 4 corresponde a la reacción 3 cuyas concentraciones fueron las ade-
cuadas para la reacción de PCR, a partir de esta estandarización se realizaron las
amplificaciones de los genes en estudio cuya secuencia de cebadores se observa
en la Tabla 2.
La amplificación del Gen uspA confirmó qué aislamientos obtenidos pertene- cían al género y la especie de Escherichia coli (Figura 3). La banda de 700 pb indicó la amplificación de una región altamente conservada del Gen uspA que confirman lo obtenido por las pruebas bioquímicas.
Figura 3. Amplificación por PCR del gen uspA. Abreviaturas: MP (Marcador de Peso Molecular); Carril 1: reacción sin ADN; Carril 2: control negativo (S. aureus); Carril 3: control positivo (E. coli ATCC®25922); Carril 4-8: cepas 115-121-191-270-286 (Fuente: propia).
Una vez estandarizadas las condiciones de la PCR, se procedió a amplifi- car los genes blaTEM (Figura 4), sólo una cepa fue positiva para el gen blaTEM (1/5; 121; 20 %) con un peso molecular equivalente a 800 pb (Figura 6), el gen blaSHV estuvo presente en todas las cepas (100 %) (Figura 5 y 6).
Figura 4. Amplificación por PCR del gen blaTEM. Abreviaturas: MP (Marcador de Peso Molecular); Carril 1: reacción sin ADN; Carril 2: control negativo; Carril 3-7: cepas 115-121-191-270-286 (Fuente propia).
Figura 5. Amplificación por PCR del gen blaSHV Abreviaturas: MP (Marcador de Peso Molecular); Carril 1: reacción sin ADN; Carril 2: control negativo; Carril 3-7: cepas 115-121-191-270-286 (Fuente propia).
En un estudio realizado por Hernández (2014) en Mérida, Venezuela, los en- sayos de amplificación por PCR permitieron detectar en la mayoría de las cepas (20/21) la presencia de la β-lactamasas CTX-M-1. El análisis de la secuencia del pro- ducto amplificado reveló la variante blaCTX-M-15, con un grado de identidad del 99 % correspondiente a la secuencia de referencia GenbanK No. AY044436. Sólo una
cepa (ECUP22) fue portadora de BLEE tipo SHV. A diferencia de este estudio donde todas las cepas fueron portadoras de este gen. En relación a las diferentes com- binaciones de BLEE, 5 cepas mostraron la asociación de por lo menos 2 tipos de b-lactamasas: blaCTX-M-15 + blaTEM-1, blaCTX-M-15 + blaSHV (2/21; 9,52 %, respectivamente) y blaSHV + blaTEM-1 (1/21; 4,76 %), mientras que en el resto de las cepas de ECUP el patrón genotípico de BLEE estuvo representado por un único gen blaCTX-M-15 (16/21; 76,19 %). En este estudio solo hubo asociación significativa (P<0,005) de blaSHV + blaTEM en una de las cepas (1/5; 121; 20 %).
Seyedjavad et al. (2016) en su investigación, la PCR indicó que las cepas pro- ductoras de BLEE presentaban genes blaCTX-M que fueron los más frecuentes (74
%), seguido por blaTEM (67 %) y, finalmente, blaSHV (45 %). 45% de 100 aislamientos
llevan más de un tipo de genes de β-lactamasas, se detectó Co-existencia de la
blaCTX-M y blaTEM en 22 aislamientos (22 %), blaCTX-M y blaSHV en 12 aislamientos (12 %), blaTEM y blaSHV en 8 aislamientos (8 %). Las bacterias son particularmente eficientes en potenciar los efectos de la resistencia, no sólo por su habilidad de multiplicarse rápidamente; sino también, por su capacidad de transferir genes de resistencia a otras cepas o especies. Las bacterias resistentes son capaces de diseminarse fácil- mente entre la población, y particularmente, en ambientes donde el uso masivo de antimicrobianos y la presencia de pacientes debilitados (hospitalizados), hacen
que la diseminación sea un fenómeno común (Perozo et al. 2009).
Figura 6. Tipos de BLEE detectados en las muestras clínicas de E. coli (Fuente propia).
Los genes que codifican para β-lactamasas son probablemente los más distri- buidos a nivel mundial. El gen blaTEM es uno de los más frecuentemente aislados (Guzmán et al. 2013; Abujnah et al. 2015). En este estudio dio positiva la amplifica- ción para determinar la presencia del gen blaTEM en una sola cepa (1/5; 121; 20 %) (Figura 4) con un peso molecular equivalente a 800pb (Figura 6), que presento plásmido con bandas de 3, 10 y >23 kpb con un perfil de resistencia a betalactámi- cos (Tabla 3), mientras que el gen blaSHV estuvo presente en todas las cepas (100
%) (Figura 6) compartiendo así dos genes de resistencia, además de esto presentan todas las cepas un plásmido en común >23 kpb, siendo por lo tanto probable que exista relación entre el gen blaSHV y este plásmido (Figura 5).
Se identificaron cepas de Escherichia coli en las muestras de urocultivos pro- venientes de pacientes de los diferentes servicios de un hospital público del estado Zulia tanto hombres como mujeres con amplio rango de edades. Encontrándose diversos patrones de susceptibilidad a antimicrobianos en las cepas de E. coli es- tudiadas. Destacando la prevalencia de cepas resistentes a ampicilina en todas las muestras analizadas así como patrones de resistencia variable a amoxicilina-ácido clavulánico y a las cefalosporinas probadas, con una sensibilidad marcada frente a carbapenémicos. Si bien se encontró una baja frecuencia de cepas productoras de BLEE, entre las E. coli estudiadas, todas las cepas con dicho fenotipo presenta- ron un perfil de resistencia característico, con el genotipo SHV, seguido de TEM, como los más frecuentes, así como un plásmido en común de gran tamaño. No se encontró el genotipo CTX-M en las cepas estudiadas con fenotipo BLEE. Por lo que se recomienda realizar estudios en diferentes grupos poblacionales para determi- nar el flujo de genes asociado al fenotipo BLEE que circulan en la región, así como realizar estudios moleculares a un mayor número de muestras, que conlleven a la búsqueda de otros tipos de BLEE, tanto en E. coli como en otros patógenos de interés clínico. Se recomienda incorporar en este tipo de estudios protocolos de curado y utilizar compuestos inhibitorios para la eliminación de plásmidos que per- mitan poder ubicar los determinantes genéticos asociados a la resistencia exhibida por las cepas evaluadas. Se debe educar al personal médico acerca de este tipo de mecanismos de resistencia encontrados y las implicaciones que tiene el uso irra- cional de antibióticos sobre la diseminación de este tipo de multirresistencia y el problema que representan a nivel de salud pública nacional.
ABUJNAH, A., A. ZORGANI, M. SABRI, H. EL-MOHAMMADY, R. KHALEK Y K. GHENGHESH.
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BOLETÍN DEL CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS
Vol.51 Nº 3___________
Esta revista fue editada en formato digital y publicada en diciembre de 2017, por el Fondo Editorial Serbiluz, Universidad del Zulia. Maracaibo-Venezuela
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