Efecto de la temperatura de conservación del medio de maduración in vitro sobre la capacidad de desarrollo de

ovocitos bovinos.

Liz Greyli Rosell Viloria1,2, Zeylin del Carmen Millano Bracho1,2, Francisco Báez Contreras1, Patricia Villamediana Monreal1, Rumualdo González Fernández2

Laboratorio de Citogenética1, Departamento de Biología, Facultad Experimental de Ciencias, Universidad del Zulia. Apartado postal 4001, Maracaibo, Estado Zulia, Venezuela.

Laboratorio de Fecundación In Vitro2, Venezolana de Inseminación artificial y Trasplante de

Embriones, C.A., Villa del Rosario, Estado Zulia, Venezuela. franciscobaez81@gmail.com*

Resumen

Un factor principal que determina las tasas de blastocistos obtenidos con la técnica de producción in vitro (PIV) de embriones, es la calidad de los ovocitos. Por tal razón, es necesario proporcionar condiciones adecuadas del sistema de cultivo para que los ovocitos se desarrollen en embriones viables. El propósito de este trabajo fue evaluar el efecto de la temperatura de conservación de un medio comercial de maduración in vitro (MIV; TCM-199) sobre la capacidad de desarrollo de ovocitos bovinos mestizos. Los ovocitos fueron recuperados a partir de ovarios de vacas sacrificadas, mediante la técnica de aspiración folicular. Los complejos cumulus- ovocito (COCs) seleccionados fueron puestos a madurar en medio de MIV fresco

y congelado/descongelado en nitrógeno líquido (N2L). Los ovocitos madurados se fecundaron in vitro (FIV) y luego los presuntos cigotos se cultivaron durante 8 días en medio de fluido oviductal sintético modificado y suplementado con aminoácidos

esenciales y no esenciales (mSOFaa) +8 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA). No se observó diferencia estadística entre las tasas de MIV-FIV y la división embrionaria entre ambos tratamientos; contrariamente, se encontraron diferencias significativas (P<0,05) en la producción de blastocistos provenientes de ovocitos madurados en medio fresco vs congelado al día 8 (29,08% vs 13,01% respectivamente). En conclusión, con el medio de MIV congelado se obtiene una adecuada maduración nuclear e igualmente proporciona una tasa de fecundación y de división embrionaria en ovocitos bovinos, similar a la aportada por el medio fresco. Este método debe seguir perfeccionándose para poder llegar a ser una alternativa para los laboratorios de PIV de embriones que requieran simplificar la rutina de trabajo tomando todas las medidas de ahorro posible y cubrir los requerimientos y demanda a gran escala.

Palabras clave: MIV; ovocitos; blastocistos; bovinos; temperatura criogénica.

Recibido: 06-05-2016 Aceptado: 20-06-2017

Effect of in vitro maturation medium on development ca-

pacity of bovine oocytes.

Abstract

A principal factor determining rates of blastocysts obtained with the technique of in vitro production (IVP) embryo is the quality of oocytes. For that reason is neces- sary to provide adequate conditions of culture system for oocytes to develop into viable embryos. The purpose of this study was to evaluate the effect of temperature preservation of a commercial medium of in vitro maturation (IVM; TCM-199) on the development capacity of bovine oocytes. The oocytes were recovered from ovaries of slaughtered cows, using the technique of follicular aspiration. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were selected and placed to mature in both, fresh and freeze/ thawin liquid nitrogen (LN2) IVM medium Matured oocytes were fertilized in vitro

(IVF) and then the presumptive zygotes were cultured for 8 days in modified syn-

thetic oviductal fluid medium supplemented with essential and nonessential amino acids (mSOFaa) + 8 mg/mL bovine serum albumin (BSA). No statistical difference in the rates of IVM-IVF and embryo division between the two treatments was obser- ved. On the contrary, significant differences (P <0.05) were found in the production of blastocysts from oocytes matured in fresh medium vs frozen on day 8 (29.08% vs 13.01% respectively). In conclusion, using frozen medium of IVM an adequate nuclear maturation is obtained of bovine oocytes. It also provides a rate of fertilization and embryo division similar to that provided by the fresh medium. This freezing method should be further improved for to become an alternative for laboratories requiring IVP of embryos simplify routine work taking into consideration all possible savings measures and meet the requirements and demand at a large-scale.

Key words: IVM, oocytes, blastocyst, bovine, cryogenic temperature.

Introducción

La producción in vitro de embriones bovinos ha sido ampliamente mejorada, particularmente en estos últimos años (Momozawa y Fukuda 2011). A pesar de haberse superado muchas dificultades que se presentaron en el desarrollo inicial de ésta técnica, muchos laboratorios han sido capaces de producir eficientemen- te embriones in vitro (Meirelles et al. 2004). Estos embriones se caracterizan por presentar un desarrollo y calidad inferior que los obtenidos in vivo. El bajo rendi- miento en la MIV de ovocitos constituye, un factor limitante en la PIV de embrio- nes (Ruiz y Astiz 2010, Caínzos 2012). Por lo tanto, la optimización del medio de maduración usado es importante para incrementar la eficiencia de los sistemas de producción (Tareq et al. 2013).

La composición de los medios y las condiciones de cultivo constituyen un com- ponente importante que afecta significativamente la MIV, además de los factores moleculares, celulares, y genéticos intrínsecos al ovocito (Christopikou et al. 2010). En numerosos laboratorios los medios de cultivo suelen ser comprados al fabrican-

te y sólo en algunos casos son preparados en el mismo laboratorio de PIV. Normal- mente, estos medios recién elaborados deben ser guardados a 4ºC y usados antes de las dos semanas de su preparación (Palasz y de La Fuente 2007).

Los componentes de los medios de cultivo como el piruvato, los antibióticos y la L-glutamina se degradan espontáneamente durante el almacenaje y por lo tanto deben ser adicionados inmediatamente antes de su utilización. Otros elementos del medio, como los factores de crecimiento y el suero pueden ser alicuotados y congelados a –70ºC. Con ésta temperatura se previene el deterioro y la desnatura- lización de las proteínas, que producen su indisolubilidad al precipitar los compo- nentes del medio (Palasz y de La Fuente 2007).

La congelación constituye una alternativa para el almacenamiento y manteni- miento del medio de MIV durante largos periodos. El nitrógeno puro es un agente frigorígeno en estado líquido que alcanza temperaturas de -196°C a presión atmos- férica (Madrid et al. 2003). Ésta capacidad de mantener bajas temperaturas en congelaciones rápidas hace que sea ampliamente utilizado para la conservación de muestras biológicas tales como sangre, esperma, ovarios u otra clase de mues- tras tisulares, manteniendo inalteradas sus propiedades (González 2014).

Al establecer parámetros de almacenamiento por largos períodos para los me- dios de MIV utilizando temperaturas criogénicas, se evita la renovación constante de medios, así como la disminución de la inconsistencia de los resultados en las rutinas de trabajo, asociada a la introducción de una gran cantidad de nuevos pro- ductos químicos y agua (Oliveira 2006). De ésta manera, se disminuyen los costos económicos relacionados con la producción, facilitando la aplicación de progra- mas comerciales (Palma 2001).

Oliveira 2006, compara medios frescos y congelados (a -80°C hasta 8 semanas) de maduración de ovocitos y de cultivo de embriones, descongelando las alícuotas congeladas a 4-5°C toda la noche antes de ser utilizadas. Es importante resaltar que es la única referencia encontrada con una investigación similar a este trabajo.

Con el propósito de ampliar el tiempo de utilidad del medio de MIV mediante la congelación, y simplificar el procedimiento de la rutina de trabajo en los laborato- rios de PIV de embriones, el objetivo de este trabajo es evaluar el efecto de conser- vación a bajas temperaturas de un medio de MIV sobre la capacidad de desarrollo de ovocitos bovinos mestizos hasta el estadio de blastocisto.

Materiales y metodos Obtención y MIV de ovocitos

Se recolectaron ovarios de vacas mestizas sacrificadas en matadero comercial y transportados al laboratorio en solución salina (0.9% NaCl) + 65 μg/mL de peni- cilina G potásica (P7794, Sigma) + 50 μg/mL de sulfato de estreptomicina (S041, Caisson Lab.) a 35-37 °C en recipientes isotérmicos en un lapso de 30 min. En el laboratorio, los ovarios se lavaron tres veces con solución salina 0.9% NaCl + 65 μg/

mL de penicilina G potásica (P7794, Sigma) + 50 μg/mL de sulfato de estreptomici- na (S041, Caisson Lab.) a 35-37°C. Los COCs se recuperaron mediante la aspiración de los folículos, con ayuda de una jeringa de 18G y suspendidos en medio TCM-199 (M2520, Sigma) suplementado con 2,2 mg/mL de NaHCO3 (31437, Riedel-de Haën),

50 mg/mL de gentamicina (G1397, Sigma), 25 mM de HEPES (H6147, Sigma), 0,4

mg/mL de BSA (A6003, Sigma) y 11,1 mg/L de heparina (H9399, Sigma). Los COCs fueron identificados bajo un microscopio estereoscópico, seleccionando aquellos con mayor tamaño, al menos tres capas completas y compactas de células del cu- mulus y citoplasma homogéneo.

El medio de maduración empleado fue el TCM-199 (M7528, Sigma), suplementa- do con 11mg/mL de piruvato sódico (PYL01, Caisson Lab.), 10 mg/mL de gentamici- na (G1272, Sigma), 43,44 mg/L de Ala-Gln (A8185, Sigma), 10µg/mL de Folltropin-V® (Bioniche), 10mg/mL de Pregnyl® (Schering-plough), 1µg/mL de 17-estradiol (E- 2758, Sigma) y 10% de FCS (S4135, Sigma). Alícuotas de este medio se almacenaron en crioviales de 1,5 mL y se congelaron en nitrógeno líquido hasta su uso. Cada criovial fue descongelado a temperatura ambiente. Tanto el medio fresco como el congelado fueron equilibrados durante 3 horas antes de utilizarse en atmósfera con 5% de CO2 en aire saturado de humedad. Los COCs fueron cultivados en grupos

de 10 en placas de Petri de 35 x 10mm en gotas de 100 µL cubiertas con aceite mi-

neral (M3516, Sigma), durante 24 h a 39ºC en una atmósfera con 5% de CO2 en aire saturado de humedad.

Fecundación in vitro

Una vez descongelada la pajuela (0,5 mL) a 37ºC por 30 s, 100 µL de semen de un toro de fertilidad conocida, fueron depositados sobre el gradiente de dos niveles de 90% y 45% de BoviPure™ (ET-AA102-UC/01, Nidacon) diluido en medio Fert-TALP contenido en un tubo eppendorf a temperatura ambiente (Folchini et al. 2012). A continuación, se centrifugó a 1.677xg durante 5 minutos en centrífuga de microtubos (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) con el propósito de sedimentar los espermatozoides viables. Luego se descartó el sobrenadante dejándose un pe- llet de 100µL que se colocó en 900µL de medio TL-FIV y se centrifugó a 1.677 xg durante 5 minutos.

Finalmente, se dejó un pellet de 100 µL aproximadamente, al cual se le de- terminó la concentración espermática mediante una cámara de Neubauer hasta alcanzar una concentración final de 1x106 espermatozoides por mL. Los COCs ma- durados fueron lavados tres veces en el medio TL-FIV, para luego ser trasladados a placas de petri de 35x10mm, en grupos de 30 estructuras a gotas de 100 L de me- dio TL-FIV suplementado con 10µg/mL de heparina (H3149, Sigma) cubiertas con aceite mineral (M3516, Sigma). Los COC´s y los espermatozoides fueron cultivados durante 18 h a 38,5ºC en una atmósfera con 5% de CO2 en aire saturado de humedad.

Cultivo in vitro de embriones

La remoción de las células del cúmulus y los espermatozoides adheridos a la su- perficie de los presuntos cigotos se realizó mediante agitación mecánica en medio TCM-199. A continuación, los presuntos cigotos fueron lavados 3 veces en ese mis- mo medio y una vez en el medio de cultivo, antes de ser depositados, en grupos de 10 en placas de petri de 35x10mm en gotas de 100µl de mSOFaa y 8 mg/mL de BSA (A8806, Sigma) según lo descrito por Holm et al. (1999). Las gotas fueron cubier- tas con aceite mineral (M3516, Sigma) e incubadas a 38,5ºC en una atmosfera con 5% de CO2 en aire saturado de humedad durante 8 días.

Valoración de los Resultados: 1.- Progresión meiótica:

Para evaluar el grado de maduración, los ovocitos fueron denudados de sus cé- lulas del cúmulus mediante agitación mecánica y fijados en una mezcla de metanol (32213, Riedel-de Haën)-ácido acético (9507-03, Baker Analyzed) en proporción 3:1 durante 48 h a 4ºC. Luego se procedió a teñirlos con aceto-orceína (OR00200025, Scharlau) al 1,1%, evaluando bajo microscopio óptico (400X) la maduración nuclear y clasificándolos según el estadio meiótico: maduros (Metafase II + corpúsculo po- lar y telofase I) o inmaduros (anafase I, metafase I, condensación cromosómica y vesícula germinal (VG)). Aquellos ovocitos que no pudieron ser incluidos en nin- guno de los grupos anteriormente nombrados se clasificaron como degenerados.

2.- Evaluación de la fecundación in vitro:

La tasa de fecundación fue determinada tomando en cuenta la penetración de los ovocitos por los espermatozoides, tras 18 h de co-cultivo. Una muestra de ovocitos de todas las placas de fecundación fue tomada, para ser fijadas en una mezcla de etanol (32221, Sigma) - ácido acético (9507-03, Baker Analyzed) en pro- porción 3:1 durante 48 h a 4ºC. Los ovocitos después de ser teñidos con aceto-or- ceína al 1,1%, fueron considerados como penetrados cuando al menos una cola de espermatozoide se encontró en su citoplasma, y siendo clasificados como:

a.- Normalmente fecundados (2PN+C): cuando en el citoplasma de los cigotos se observaron 2 pronúcleos, uno femenino y otro masculino, y una cola de esper- matozoide o bien, una cabeza de espermatozoide descondensándose acompaña- da de su cola y de un pronúcleo femenino.

b.- Asincrónicos: en este grupo, aquellos ovocitos que fueron penetrados sola- mente por un espermatozoide, pero se observó alguna alteración o retraso mar- cado en la formación de los pronúcleos, como la cabeza del espermatozoide no descondensada o una telofase II.

c.- Polispérmicos (>2PN): los cigotos en los que se observaron más de 2 pro- núcleos en su citoplasma y los dos corpúsculos polares, más de dos cabezas de espermatozoides descondensándose o más de dos colas en su citoplasma.

3.- Evaluación de la división y desarrollo embrionario:

La tasa de división embrionaria se evaluó a las 72 horas post inseminación (hpi), tomando en cuenta el total de embriones de 2 o más células en relación al total de ovocitos puestos a fecundar. Después de 7 y 8 días de cultivo, los embriones fue- ron observados bajo microscopio estereoscópico (Olympus, SZX12, Japón).

4.- Análisis Estadístico:

Los resultados obtenidos de las tasas de maduración, fecundación, división embrionaria y de blastocistos fueron expresados como frecuencias y analizados mediante el test de χ2del paquete estadístico SAS®. Las diferencias entre las fre- cuencias se consideraron significativas para valores de P< 0,05.

Resultados

Un total de 1.074 ovarios fueron procesados, de los cuales se obtuvieron 3.048COCs seleccionados como aptos para la MIV, para un promedio de 3,37 COCs por ovario. En la Tabla 1, se muestran los resultados de la progresión meiótica de COCs bovinos MIV. De los ovocitos madurados en el medio fresco, se evaluaron 159 COCs obteniendo una tasa de maduración de 72,32%; mientras que, para el me- dio congelado se evaluaron 157 COCs de los cuales 73,88% fueron ovocitos madu- ros, sin diferencias (P>0,05; Fig. 1 y 2).

Tabla 1. Progresión meiótica de ovocitos bovinos madurados in vitro en medio de maduración fresco y congelado.

Telo I: telofase I. MII: metafase II. AnaI: anafase I. MI: metafase I.CCII: condensación cromosómica

II. N° de Deg: Ovocitos degenerados. COCs: Complejos cumulus-ovocitos.

Figura 1. (A) Ovocitos bovinos inmaduros, (B) Ovocitos bovinos MIV con medio fresco, y (C) ovocitos bovinos MIV con medio congelado. Aumento 50X.

Figura 2. Progresión meiótica de ovocitos bovinos madurados in vitro (400X): (A) MII+CP, (B) MI.

Para determinar la tasa de fecundación (Tabla 2), se evaluaron 149 presuntos cigotos cultivados en medio de maduración fresco, lográndose una tasa de pe- netración de 66%. Con respecto a los presuntos cigotos cultivados en medio de maduración congelado, se evaluaron 179, de los cuales se obtuvo una tasa de pe- netración de 67,03%, sin diferencias entre ambos grupos (P>0,05; Fig. 3).

Tabla 2. Tasa de fecundación in vitro de ovocitos bovinos madurados in vitro en medio de maduración fresco y congelado.

Figura 3. Valoración de la fecundación in vitro (400X): ovocitos penetrados: (A) 2PN,

(B) 1 PN, (C) 3PN.

Un total de 644 presuntos cigotos fueron CIV. Transcurridas 48 h de cultivo se procedió a evaluar la división embrionaria, obteniendo un porcentaje de embrio- nes de 81,37% para el tratamiento de MIV en medio fresco y 76,03% para el medio congelado (Figura 4). En el día 8 de cultivo, la tasa de desarrollo (Tabla 3) alcanzada por los embriones provenientes de ovocitos madurados en medio fresco y conge- lado fue de 29,08% y 13,01% respectivamente, encontrándose diferencias (P<0,05).

Figura 4. División y desarrollo embrionario (50X): (A) embriones bovinos de 3 días de cultivo y (B) blastocistos expandidos de 6 días de cultivo, procedentes de ovocitos ma- durados con medio de MIV congelado. (C) Embriones bovinos de 3 días de cultivo y

(D) blastocistos expandidos de 6 días de cultivo, procedentes de ovocitos madurados

con medio de MIV fresco.

Tabla 3. Evaluación del desarrollo de embriones bovinos PIV.

N: presuntos cigotos puestos en cultivo

a,b: valores en la misma columna con diferente superíndice difieren significativamente

(P<0,05).

Discusión

Actualmente, es más frecuente la utilización de medios almacenados a tempe- raturas criogénicas para la PIV de embriones bovinos. Las principales ventajas de este método de almacenamiento son: simplificación de la técnica, resultados con mayor repetibilidad, reducción de los costos y una mejor consistencia en los resultados obtenidos en la rutina de laboratorio (Oliveira 2006). Báez et al. (2008), y Báez et al. (2014), reportaron en cada caso una tasa de ovocitos maduros de 61,36% y 65,71%; mientras que Peláez et al. (2012), obtuvieron una tasa de ma- duración de 55,55% con ovocitos provenientes de hembras mestizas sacrificadas y madurados en medio de maduración fresco.

Resultados de tasas de maduración similares a los obtenidos en este trabajo fueron logrados por Hernández y Hernández (2010), de 72,77%, al igual que Salga- do et al. (2013), de 70,3% y Asaf et al. (2014), de70%. Por su parte, Ahuja et al. (2009), lograron una tasa superior con 89,7% de ovocitos que alcanzaron la metafase II en medio fresco. Cabe destacar, que solo se realizaron comparaciones de este trabajo con otros, en los cuales utilizan medios de maduración fresco, debido a las pocas investigaciones con medios congelados. Estos datos sugieren que el sistema de MIV utilizando medio congelado soporta de manera similar la maduración nuclear de ovocitos bovinos madurados en medio fresco.

Sieren y Youngs (2001), utilizando el gradiente de densidad BoviPure® (Nida- con) para realizar la separación espermática obtuvieron una tasa de penetración de ovocitos de 77,2%, superior a las logradas en este trabajo. Por su parte, Peláez et al. (2012), utilizando un gradiente discontinuo de Percoll® obtuvieron 38% de ovo- citos penetrados, resultando inferior al obtenido en esta investigación. Samardzija et al. (2006), comparando diferentes métodos de separación espermática para la FIV, demostraron que el gradiente de densidad BoviPure® incrementó de manera satisfactoria la tasa de movilidad en un 70%.

Valeanu et al. (2015), evaluando los parámetros funcionales de los espermato- zoides bovinos antes y después de la separación por centrifugación de una sola capa (SLC) usando el gradiente de densidad BoviPure®, encontraron que mejoró significativamente la calidad del semen de toro congelado-descongelado, selec- cionando aquellos espermatozoides que eran móviles, y con buena integridad de la membrana.

En cuanto al desarrollo embrionario, Jo et al. (2014), después de 48 h de CIV lo- graron una tasa de división de 71,6%. Así mismo, Guimarães et al. (2014), Guimarães et al. (2015) y Ancco et al. (2015), obtuvieron tasas de división embrionaria similares que oscilan entre el 77%-87%, 78,4%-82,1% y 77,7%-87,9% respectivamente.

Oliveira (2006), evaluando las técnicas de simplificación de la rutina de PIV de embriones bovinos, demostró que no se encontraron diferencias en las tasas de blastocistos ni cambios en la morfología cuando se probaron medios de MIV y de CIV congelados, dando a conocer que la congelación relativamente rápida a -80°C y la descongelación lenta a 4-5°C no modifica las propiedades generales del medio, sin causar precipitación o cambios de color en el mismo, después de la desconge- lación. Esto sugiere que las propiedades biológicas del medio para soportar la MIV y el CIV no fueron modificadas. En la presente investigación se pudo apreciar una diferencia significativa (P<0,05) en las tasas de blastocistos derivados de los ovo- citos cultivados en medio fresco y congelado (29,08% y 13,01% respectivamente).

Zullo et al. (2016), al evaluar el efecto de la administración de L-ergotioneina (antioxidante y aminoácido de origen natural) al medio de CIV en el desarrollo y calidad de blastocistos bovinos, obtuvieron resultados similares al de esta investi- gación, con valores entre 18,4% y 23,6% de blastocistos cultivados en medio SOFaa

+ 5% suero bovino adulto (BS, siglas en inglés). Por su parte, Dovolou et al. (2014), mostraron una tasa de blastocistos de 30% a los 8 días de cultivo en mSOF + 16 mg/mL de BSA; mientras que Da Costa et al. (2015), reportan tasas de blastocis- tos cultivados en medio SOF + 3 mg/mL BSA +5% SFB que oscilan entre 21% y 41%, al investigar el efecto de la adición de cortisol durante la MIV de ovocitos bovi- nos. Leivas et al. (2011), observaron un incremento en las tasas de blastocistos, mediante la adición de 2% de suero fetal bovino (FCS por sus siglas en inglés), en relación al cultivo con BSA sin la adición de FCS, utilizando ovocitos recuperados por ovum pick-up (OPU) provenientes de donadoras Bos taurus indicus. Estos au- tores afirman que empleando una concentración de 2% de suero o asociándolo con BSA no se observó un efecto bifásico por parte del suero sobre la calidad de los blastocistos obtenidos.

El desarrollo de nuevas estrategias para reducir la inconsistencia en los resul- tados obtenidos en cada una de las etapas de PIV de embriones bovinos se consi- dera fundamental a los efectos de incrementar la eficiencia de esta biotecnología. Consideramos, que los medios congelados constituyen una práctica alternativa para los laboratorios de investigación que requieren reducir gastos de reactivos y tiempo de labor.

Conclusiones

El medio de maduración congelado/descongelado aporta tasas de MIV y FIV similares a las del medio de maduración fresco. De igual manera, puede soportar la capacidad de desarrollo de ovocitos bovinos hasta la etapa de blastocisto. Como conclusión, la congelación de medios representa una alternativa para el ahorro de reactivos, tiempo y reducción de los costos económicos.

Literatura citada

AHUJA, C., F. MONTIEL, P. PÉREZ Y J. GALLEGOS. 2009. Medio alternativo para la produc- ción in vitro de embriones bovinos. Zootecnia Tropical. 27: 277-284.

ANCCO, E., D. DIPAZ, C. QUISPE, K. ORIUNDO Y E. MELLISHO. 2015. Desarrollo de embrio-

nes bovinos in vitro después de la fecundación de ovocitos usando semen de dife- rentes toros. Spermova. 5:129-133.

ASAF, S., G. LEITNER, O. FURMAN, Y. LAVON, D. KALO, D. WOLFENSON Y Z. ROTH. 2014.

Effects of Escherichia coli and Staphylococcus aureus induced mastitis in lactating cows on oocyte developmental competence. Reproduction. 147:33-43.

BÁEZ, F., L. HERNÁNDEZ Y P. VILLAMEDIANA. 2008. Estudio estructural del huso meiótico

de ovocitos bovinos vitrificados. Revista Científica FCV-LUZ 18:253-261.

BÁEZ, F., Y. MÉNDEZ Y P. VILLAMEDIANA. 2014. Complemento cromosómico de embriones bovinos (Bos Taurus indicus) producidos in vitro. CIENCIA. 22:14 – 20.

CAÍNZOS, J. 2012. Diseño de un medio definido para la maduración in vitro de ovocitos bovinos en baja tensión de oxígeno. Tesis Doctoral. Dpto. de Patología Animal, Fa- cultad De Veterinaria De Lugo, Universidad de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, 193 pp.

CHRISTOPIKOU, D., C. KARAMALEGOS, S. DORIZA, M. ARGYROU, P. SISI, S. DAVIES Y M.

MASTROMINAS. 2010. Spindle and chromosome configurations of human oocytes matured in vitro in two different culture media. Reproductive Bio Medicine Online 20:639– 648.

DA COSTA, N., K. LINS BRITO, P. DI PAULA BESSA SANTANA, M. DA SILVA CORDEIRO, T. VELASCO GUIMARÃES SILVA, A. XIMENES SANTOS, P. DO CARMO DE AZEVEDO RA- MOS, S. DO SOCORRO DAMASCENO SANTOS, W. ALLAN KING, M. DOS SANTOS

MIRANDA Y O. MITIO OHASHI. 2015. Effect of cortisol on bovine oocyte maturation

and embryo development in vitro. Theriogenology. 85:323-329.

DOVOLOU, E., E. PERIQUESTA, I. MESSINIS, T. TSILIGIANNI, K. DAFOPOULOS, A. GUTIE-

RREZ Y G. AMIRIDIS. 2014. Daily supplementation with ghrelin improves in vitro bo- vine blastocysts formation rate and alters gene expression related to embryo qual- ity. Theriogenology. 81:565-571.

FOLCHINI, N., F. LEIVAS, F. SANTOS, E. SCHWENGBER, D. MARTIN, C. SPIAZZI Y D. BRUM.

2012. Uso de mini-Percoll modificado para seleção e redução da formação de espé- ciesreativas de oxigênio (ROS) em espermatozoides bovinos. Revista Brasileira De Reprodução Animal. 36:239-244.

GONZALEZ, R. 2014. Criogenia cálculo de equipos recipientes a presión. Ediciones Díaz de

Santos. pp 5-6.

GUIMARÃES, A., F. LEIVAS, F. SANTOS, E. SCHWENGBER, A. GIOTTO, C. MACHADO, C. GON-

CALVES, N. FOLCHINI Y D. BRUM. 2014. Reduction of centrifugation force in dis- continuous percoll gradients increases in vitro fertilization rates without reducing bovine sperm recovery. Animal Reproduction Science. 146: 103–110.

GUIMARÃES, A., S. PEREIRA, L. LEME Y M. DODE. 2015. Evaluation of the simulated physio- logical oocyte maturation system for improving bovine in vitro embryo production. Theriogenology. 83:52–57.

HERNÁNDEZ, A. Y H. HERNÁNDEZ. 2010. Efecto de la suplementación con L-cisteína en la

maduración in vitro de ovocitos bovinos. Revista Científica FCV-LUZ. 20:268 – 273.

HOLM, P., P.J. BOOTH, M.H. SCHMIDT, T. GREVE Y H. CALLENSEN.1999. High bovine blasto-

cyst development in a static in vitro production system using SOFaaci medium sup- plemented with sodium citrate and myo-inositol with or without serum proteins. Theriogenology. 52:683–700.

JO, H., J. BANG, S. KIM, B. CHOI, J. JIN, H. KIM, I. JUNG, T. SUH, N. GHANEM, Z. WANG Y I.

KONG. 2014. Production of female bovine embryos with sex-sorted sperm using in- tracytoplasmic sperm injection: Efficiency and in vitro developmental competence. Theriogenology. 81:675–682.

LEIVAS, F., D. BRUM, S. FIALHO, W. SALIBA, M. ALVIM, M. BERNARDI, M. RUBIN Y C. SILVA.

2011. Fetal calf serum enhances in vitro production of Bos taurus indicus embryos.

Theriogenology. 75:429–433.

MADRID, A., J. GÓMEZ-PASTRANA, F. SANTIAGO, J. MADRID Y J. CENZANO. 2003. Refri-

geración, congelación y envasado de los alimentos. Ediciones Mundi-Prensa. pp 57.

MEIRELLES, F., A. CAETANO, Y. WATANABE, P. RIPAMONTE, S. CARAMBULA, G. MERIGHE,

Y S. GARCÍA. 2004. Genome activation and developmental block in bovine embryos.

Animal Reproduction Science. 83:13-20.

MOMOZAWA, K. Y Y. FUKUDA. 2011. Establishment of an advanced chemically defined me- dium for early embryos derived from in vitro matured and fertilized bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development 57:681-689.

OLIVEIRA, D. 2006. Produção in vitro de embriões: cultivo de embriões pós-eclosão e criopreservação de meios prontos para uso. Tese de Doutorado. Instituto de Cién- cias Biológicas, Univ. De Brasília, Brasília, 106 pp.

PALASZ, A. Y J. DE LA FUENTE. 2007. Cultivo de embriones bovinos: efecto de los medios de cultivo y de los requerimientos fisiológicos sobre la calidad de los embriones pro- ducidos in vitro. Revista Cría y Salud Bovina. N° 9:36-42.

PALMA, G. 2001. Biotecnología de la reproducción. Argentina. Ediciones INTA. pp 273.

PELÁEZ, J., Y. URRIBARRÍ, A. PIRELA, F. BAEZ, P. VILLAMEDIANA Y H. HERNANDEZ. 2012.

Influencia de la predominancia racial sobre la competencia de maduración, fecun- dación y desarrollo in vitro de ovocitos bovinos. Ciencias del Agro, Ingeniería y Tec- nología 3: 21-42.

RUIZ, S. Y S. ASTIZ. 2010. Producción in vitro de embriones (PIV) en biotecnología de la

reproducción bovina. ANEMBE. 88: 25-32.

SALGADO, R., J. SIMANCA Y O. VERGARA. 2013. Efecto del factor de crecimiento epidermal (EGF) sobre la maduración de ovocitos bovinos cultivados in vitro. Revista Científica FCV-LUZ 23:325-328.

SAMARDZIJA, M., M. KARADJOLE, I. GETZ, Z. MAKEK, M. CERGOLJ Y T. DOBRANIC. 2006.

Effects of bovine spermatozoa preparation on embryonic development in vitro. Re- productive Biology and Endocrinology. 4:58:1-7.

SIEREN, K. Y C. YOUNGS. 2001. Assessment of BoviPureTM for the in vitro production of bovine embryos. Beef Research Report. Iowa State University, A.S. EE.UU. Leaflet R 1768, 3 pp.

TAREQ, K., Q. AKTER, H. TSUJII, M. YAHIA KHANDOKER Y I. CHOI. 2013. Effect of dipeptides

on in vitro maturation, fertilization and subsequent embryonic development of por- cine oocytes. Asian - Australasian Journal of Animal Sciences. 26: 501-508.

VALEANU, S. D. DRUGOCIU Y P. ROSCA. 2015. Effect of Single layer centrifugation using BoviPure on frozen-thawed bovine sperm during a 6 hours survival test. Romanian Biotechnological Letters. 20:10327-10333.

ZULLO, G., G. ALBERO, G. NEGLIA, C. DE CANDITIIS, G. BIFULCO, G. CAMPANILE Y B. GAS-

PARRINI. 2016. L-ergothioneine supplementation during culture improves quality of

bovine in vitro–produced embryos. Theriogenology. 85:688–697.

BOLETÍN DEL CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS

Vol.51 Nº 1___________

Esta revista fue editada en formato digital y publicada en abril de 2017, por el Fondo Editorial Serbiluz, Universidad del Zulia. Maracaibo-Venezuela

www.luz.edu.ve www.serbi.luz.edu.ve produccioncientifica.luz.edu.ve