ISSN 2477-9458
BOLETÍN DEL
CENTRO DE
INVESTIGACIONES
BIOLÓGICAS
TASAS DE FAGOCITOSIS EN LAS ESPECIES DE ACANTHAMOEBA PROVENIENTES
DE AGUAS SUBTERRÁNEAS. PARTE I.
Silvana B. Pertuz Belloso, Deyamira Matuz Mares, Emelia Campoy,
Miroslav Macek y Elizabeth Ramírez Flores................................................
CLASIFICACIÓN DE NUEVOS MICROHÁBITATS DE AGUA SALOBRE EN VENEZUELA.
CONSIDERACIONES BIOECOLÓGICAS SOBRE LAS ESPECIES DE INSECTOS
ACUÁTICOS EN LA PENÍNSULA DE ARAYA.
Erickxander Jiménez-Ramos, Mauricio García y Vanessa Acosta.................
EATING THE FORBIDDEN FRUIT? AVOCADO CONSUMPTION BY NEOTROPICALES
AT AN URBAN GARDEN.
Andrés E. Seijas...............................................................................................
MICROMOLUSCOS DEL CONTENIDO ESTOMACAL DE ASTEROIDEOS DEL GÉNERO
ASTROPECTEN: ORIGEN DE UNA COLECCIÓN DE REFERENCIA.
Ricardo Bitter-Soto y Ronald Rivas-Suarez................................................
INSTRUCCIONES A LOS AUTORES............................................................................
INSTRUCTIONS FOR AUTHORS..................................................................................
Vol.55, N
0
1, Enero-Junio 2021
UNA REVISTA INTERNACIONAL DE BIOLOGÍA
PUBLICADA POR LA
UNIVERSIDAD DEL ZULIA, MARACAIBO,
VENEZUELA
1
29
57
70
92
102
Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas
Vol. 55. Nº 1, Enero- Junio 2021, Pp. 1-28
1
T
ASA DE FAGOCITOSIS EN LAS ESPECIES DE
A
CANTHAMOEBA
PROVENIENTES DE AGUAS SUBTERRÁNEAS
.
P
ARTE
I.
Silvana B. Pertuz Belloso*
1,2
, Deyamira Matuz Mares
3
, Emelia Campoy
4
, Miroslav
Macek
4
y Elizabeth Ramírez Flores
4
.
1
Fundación B Chemokines Molecules and Therapies. Pachuca de Soto.
Estado de Hidalgo. México.
2
Departamento de Biología Comparativa. Facultad de Ciencias. Biología.
Universidad Nacional Autónoma de México. CDMX. México.
3
Departamento de Coordinación de Profesores. Facultad de Medicina.
Universidad Nacional Autónoma de México. CDMX. México.
4
Facultad de Estudios Superiores de Iztacala. Universidad Nacional
Autónoma de México. Estado de México. México.
*Autor para correspondencia: E-mail y redes sociales. spertuzster@gmail.com.
@silvanapertusis. @BiomedicaUNAM. Dir. Privada de Hidalgo. No. 104 Int. 4.
Calle de Hidalgo. Col. Centro. Cp. 42000. Estado de Hidalgo. México.
RESUMEN
Las especies de Acanthamoeba pertenecen a la Subclase Gymnamoebia, una subclase
de amebas de vida libre. Las amebas de vida libre son cosmopolitas con distribución
en todo el mundo. Uno de los procesos biológicos más estudiados es la fagocitosis,
especialmente, en especies de Acanthamoeba patogénicas. La fagocitosis ocurre
gracias a mecanismos moleculares, como el reconocimiento de carbohidratos sobre la
superficie bacteriana, y la activación de procesos celulares como la formación de
fagosomas y la fusión con los lisosomas para digestión. En el ambiente esta función
es poco estudiada y se plantea aquí que juega un papel en la regulación de bacterias y
otros protozoarios. El objetivo de este trabajo es la caracterización de la fagocitosis
de las especies de Acanthamoeba aisladas de aguas subterráneas del Valle del
Mezquital (Estado de Hidalgo, México). La fagocitosis fue analizada en placas de
Petri con agar no nutritivo cubierto con bacterias teñidas con fluorescencia inoculadas
con cepas de Acanthamoeba e incubadas a 30°C, ½ h, 1 h, 1 ½ h y luego recuperadas
para el protocolo de tinción de Sherr et al. (1987) modificado. La fagocitosis fue alta
a la ½ hora de interacción con las bacterias, disminuyendo a la 1 hora. El proceso
celular de fagocitosis mostrado en este trabajo, inicia con la formación de
seudópodos especiales para englobar las bacterias, que son capturadas en flóculos,
formando fagosomas regulados por el tiempo de digestión.
Palabras clave: Acanthamoeba culbertsoni; Acanthamoeba castellanii; Valle del
Mezquital; aguas subterráneas; fagocitosis; fagosoma, vacuolas alimenticias.
Fagocitosis en Acanthamoeba.
2
Pertuz Belloso et al.
R
ATE OF PHAGOCYTOSIS OF
A
CANTHAMOEBA
SPECIES FROM
GROUNDWATER
.
P
ART
I.
ABSTRACT
The Acanthamoeba species belonging to subclass of Gymnamoebia, a class of free
living amoeba. Acanthamoeba species are cosmopolitan with distribution in the
world. The phagocytosis is a biological mechanism more studied, especially in the
pathogenic Acanthamoeba species. Many molecular mechanisms turn on the
phagocytosis, between them carbohydrates recognition on the bacterial surface, and
the activation of cellular mechanisms, as the phagosome formation and the fusion
with the lysosomes for digestion. In the environment this function has been not
studied, and here we have idea that this process is important in regulation of bacteria
and others protozoa. The objective of work is the characterization of the phagocytosis
of Acanthamoeba species isolated from Mezquital Valley groundwater (State of
Hidalgo, Mexico). The phagocytosis was analyzed on non-nutritive agar Petri Plates
with fluorescent label bacteria inoculate with Acanthamoeba and incubated by 30°C,
1 h, 1 ½ h, and then they were recovered to stained using to protocol of Sherr et al.
(1993), modified. The phagocytosis of Acanthamoeba was higher to ½ hour of the
interaction with fluorescent label bacteria (FLB), and reduced to 1 hour. The cellular
process of phagocytosis showed in the work, started with the special pseudopods to
trapped bacteria in floccules, forming phagosomes that regulated by time of the
digestion.
Key Words: Acanthamoeba culbertsoni; Acanthamoeba castellanii; Mezquital
Valley; groundwaters; phagocytosis; phagosomes.
Recibido / Received: 27-08-2020 ~ Aceptado / Accepted: 05-04-2021
INTRODUCCIÓN
Acanthamoeba es un género de amebas de vida libre perteneciente al grupo de
Gymnamoeba; que característicamente presenta un ciclo de vida, muy conocido, en el
cual existe una fase libre o trofozoíto o vegetativa y otra quística que tiene un valor
taxonómico (Castrillón y Orozco 2013).
Matuz (2001) en su trabajo sobre aguas subterráneas describe la biodiversidad y la
importancia que tiene este grupo en estos ambientes. Gallegos-Neyra et al. 2014,
describen que México es un país con una biodiversidad preponderante de especies de
Acanthamoeba, con una biodistribución especial en Ciudad de México, Hidalgo, Baja
California y Puebla, con más de 315 aislamientos de Gymnamoeba, incluyendo
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Acanthamoeba. Pertuz y Jiménez (2015) aislaron amebas de vida libre,
principalmente del género Acanthamoeba en diversos ambientes, incluyendo piscinas
deportivas, mostrando la propiedad que tienen estos protistas de ser cosmopolitas y
de gran biodiversidad en todo el mundo, considerando a Latinoamérica como franja
de mayor biodiversidad de estas especies.
Acanthamoeba y otras amebas de vida libre juegan un rol en el control de las
poblaciones bacterianas en ambientes en donde prevalecen las interfaces suelo-agua
en sedimentos o en suelos y en cavidades humanas. Los mecanismos empleados por
estas especies para ejercer regulación de las poblaciones bacterianas no se conocen
totalmente. Una de estas estrategias está bien ejemplificada por Rogerson et al.
(1996), quienes muestran que las poblaciones de amebas de vida libre marinas
aumentan la superficie de contacto para atrapar más bacterias, ejerciendo presión
sobre las bacterias en ambientes marinos. Weeker et al. (1993) encontraron que las
amebas de vida libre aisladas de suelo, como Acanthamoeba castellanaii,
Acanthamoeba polyphaga y Hartmannella vermiformis ejercen presión o control
sobre las poblaciones bacterianas; principalmente bacterias pertenecientes a la familia
Enterobacteriae.
Tomando como modelo ecológico comunidades de biopelículas formadas sobre los
lentes de contacto, se ha encontrado una relación entre el control de las poblaciones
bacterianas y las amebas de vida libre. Bottone et al. (1992) usando Xanthomonas
maltophilia aislada de la solución de lavado de los lentes de contacto y co-cultivadas
con A. castellanii o A. polyphaga, encontraron que los trofozoítos crecían
abundantemente.
En otro estudio, se encontró que la detección de bacterias patógenas, como
Mycobacterium, Legionella sp., y Chlamydia han sido reportados en biopelículas
formadas en tuberías de agua de hospitales y suministros de agua potable, en los
cuales, las comunidades están formadas por varias especies de protozoarios entre
ellos, las especies del género Acanthamoeba, como Acanthamoeba sp., Harmantnella
sp, A. castellanii o H. vermiformis (Valster et al. 2011, Atif-Nisar et al. 2020).
Por otro lado, las especies del género de Acanthamoeba presentan un sistema
vacuolar complejo, el cual está regulado por factores como el tiempo de ingestión y la
fase de captura de bacterias. Allen y Dawidowicz (1990) encontraron que la
capacidad de ingestión de las amebas de vida libre está regulada por la formación de
las vacuolas alimenticias que depende del tiempo digestión del material ingerido y
de la saturación del sistema vacuolar.
Fagocitosis en Acanthamoeba.
4
Pertuz Belloso et al.
Avery et al. (1995), por su parte, señalan que la fagocitosis no es más que un
mecanismo activado por la unión de las bacterias a la superficie amebiana y que está
limitado, como se dijo anteriormente, por este complejo sistema vacuolar.
Está claro que tanto la regulación del sistema vacuolar, así como la fagocitosis
misma y su importancia biológica aún no ha sido dilucidada completamente. El
objetivo de este estudio es caracterizar la fagocitosis de las especies de
Acanthamoeba del Valle del Mezquital (Hidalgo, México), como un mecanismo para
la regulación de la población bacteriana. Además de identificar a nivel celular el
proceso de fagocitosis en las especies de Acanthamoeba del Valle de Mezquital.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sitio de muestreo.
Valle de Mezquital, Estado de Hidalgo: 99°23´-98°55´de longitud oeste y 20°20´-20°
30´ de latitud norte.
Especies.
Las especies Enterobactera erogenes (13048) (Klebsiella aerogenes de acuerdo a
Tindall et al. 2017), Acanthamoeba culbertsoni (30171) y Acanthamoeba castellanii
(30011) utilizadas en este estudio pertenecen a la Colección Americana de Cultivos.
Los aislados ambientales Acanthamoeba culbertsoni y Acanthamoeba castellanii
utilizados en este estudio fueron del Valle del Mezquital (Hidalgo, México).
Aislamiento de las cepas del Valle del Mezquital.
El aislamiento de las cepas ambientales fue realizado de acuerdo a Matuz (2001).
Las muestras fueron tomadas de aguas subterráneas y luego concentradas por
centrifugación a 1201 x g por 10 min. El sobrenadante fue descartado y la pelotilla
fue sembrada sobre placas de Petri con agar no nutritivo con K. aerogenes
previamente inactivada.
Cultivos de las cepas del Valle de Mezquital.
Las cepas ambientales fueron proporcionadas en cultivo axénico en Chang
modificado [Medio Bactopeptona con suero bovino y medio Ringer].
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Condiciones fisiológicas del cultivo de Acanthamoeba.
Altas concentraciones de amebas de vida libre fueron obtenidas en medio PGY
[Peptona Proteosa 3.75 g, sacarosa 6.75 g, extracto de levadura 3.75 g, 1 l AD,
GIBCO] a 30°Cen botellas de cultivo (75 cm
3
). A. culbertsoni de referencia fue
mantenida en monocultivo en medio PGY con antibióticos [Infusión de sulfato de
Estreptomicina 0.28 µl en solución salina de Penicilina G, 2.8 unidades en 30 ml,
GIBCO].
Curva de crecimiento bacteriana.
Un cultivo masivo de K. aerogenes fue probado para realizar la curva de
crecimiento bacteriana de acuerdo al protocolo estándar. El crecimiento bacteriano
fue medido por espectrofotometría durante 24 horas hasta llegar al punto máximo de
crecimiento. El crecimiento bacteriano fue determinado a 530 nm del espectro de luz
en espectrofotómetro de uso general y expresado en unidades arbitrarias de
absorbancia.
Curva de crecimiento de especies de Acanthamoeba.
A. castellanii y A. culbertsoni del Valle del Mezquital fueron inoculadas a una
concentración inicial de 1 x 10
6
cels/ml en cajas de cultivo (75 cm
3
) conteniendo
medio PGY con suero fetal bovino al 10% (GIBCO), e incubado a 30°C por 5 a 9
días. Posteriormente, los trofozoítos fueron observados cada 24 h en microscopio de
inversión y una alícuota del cultivo fue colocada en cámara de Neubauer para su
cuantificación, usando los cuadros grandes. Las tasas de crecimiento de las diferentes
especies fueron calculadas usando una relación entre los contajes del tiempo 0 y los
contajes del tiempo en cuestión en una matriz de datos por triplicado, que fueron
sometidos a una media aritmética para la construcción de la curva de crecimiento.
Pruebas de patogenicidad.
Los trofozoítos de Acanthamoeba fueron incubados a 30°C durante 2 días en medio
Chang modificado y concentrados de 1 x 10
3
a 1 x10
5
cels/ml por centrifugación a
161 x g por 15 min. Posteriormente, ratones blancos de la cepa CD-1 (machos de tres
semanas de edad) fueron inoculados vía nasal con 0.02 ml del medio conteniendo el
concentrado de los trofozoítos. Durante 21 días, los ratones fueron observados hasta
Fagocitosis en Acanthamoeba.
6
Pertuz Belloso et al.
su muerte, siguiendo los protocolos estándares de los bioterios y tomando las medidas
de ética en este campo. Los ratones fueron sacrificados tras este tiempo y sus órganos,
principalmente: Los pulmones, bazo, hígado y el cerebro fueron extraídos y
colocados en placas de Petri con agar no nutritivo e incubados a 30°C para la
recuperación de las amebas de vida libre. Para esto se determinaba la migración y
patogenicidad, a partir del análisis de los halos que se formaban alrededor de los
órganos y de allí se practicaron cortes del agar y observación en microscopio
invertido.
Marcaje fluorescente bacteriano con 5-DTAF ([5-(4,6-Dichlorotriazinnyl)
aminofluorescein]).
Un stock de K. aerogenes fue cultivado y cosechado masivamente en medio
Bactopeptona al 1% a 37°C durante 18 h (Fase exponencial), fue concentrado y
teñido con DTAF (2 mM, Sigma- Aldrich) de acuerdo a Sherr et al. (1987).
Ensayos de fagocitosis.
Las bacterias teñidas fluorescentes (FLB) fueron dispensadas sobre placas de agar
no nutritivo (de 4 mm de grosor) a una concentración de 1 x 10
8
bac/ml. Luego, las
amebas de vida libre fueron incubadas a una concentración de 1 x 10
6
cels/ml por
30°C durante, 1 ½ h. La fagocitosis fue parada cada 30 min con PBS frío (pH 7.0)
[NaCl 8 g, KCl 0.2g, Na2 HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24 g, 1 l AD], y fijado con
glutaraldehído (2.5 %) frío por 1 min. Luego las placas fueron frotadas con una
varilla de vidrio con goma, y lavadas con PBS (pH 7.0). La suspensión fue transferida
a microtubos (2 ml) y luego filtradas sobre membranas de policarbonato.
Tinción trofozoítos de Acanthamoeba con DAPI (4, 6-Diamidino-2-
phenylindole).
Las muestras conteniendo los trofozoítos fueron transferidas a membranas de
policarbonato (poro 2 µm de diámetro, negras Millipore, USA), en un sistema de
microfiltración (Acero inoxidable de 2 mm de diámetro, Millipore, USA), de acuerdo
a Sherr et al. (1987). Posteriormente, las membranas conteniendo los trofozoítos
fueron teñidas con DAPI (2 mM, Sigma- Aldrich) e incubado durante 2 min a RT.
Luego, estas preparaciones fueron montadas para su observación por microscopía de
fluorescencia (Zeiss, Alemania; excitación UV, set de filtros para DAPI).
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Análisis por microscopía de fluorescencia de la fagocitosis de las diferentes
especies de
Acanthamoeba.
La fagocitosis fue observada en cada preparación por microscopía de
epifluorescencia, entre 350 nm de excitación a 450 nm de emisión del espectro de luz
para el DAPI (Indol- Carboxamidina) y 494 nm de excitación y de 575 nm de emisión
del espectro de luz, correspondiente a DTAF (5-4, 6-diclorotrizianil-
aminofluoresceína). En cada condición, fueron analizadas más de 150 amebas para
observar el contenido vacuolar y el número de vacuolas por individuo a un aumento
de 1000x (Inmersión). Para algunos de los ensayos se utilizó la prueba de
apagamiento de acuerdo a Loike y Silverstein (1983), modificado. Las membranas
conteniendo las amebas fueron incubadas con un amortiguador de PBS-1x-azul
tripano (2 mg/ml)-Azida de Sodio (0.8%), por 2 min para observar solo el contenido
vacuolar de cada ameba.
Análisis de imágenes y picos de intensidad de fluorescencia.
El contenido vacuolar detallado fue analizado sobre las muestras usando el
programa IMAGEJ de Java, con el cual se realizó un análisis del contenido de cada
vacuola, por cada célula, por intensidad de la fluorescencia que fueron luego
comparadas por tiempo por célula.
Análisis estadístico.
Las medias del contenido vacuolar de cada célula fueron comparadas por ANOVA,
con límites de confianza del 95% y con la probabilidad de p≤0.05 usando el programa
ORIGIN 6.0.
RESULTADOS
En la Figura 1se muestra el crecimiento bacteriano que se disparó a las 18 h en
condiciones estándares del cultivo de K. aerogenes. La absorbancia del medio sin
bacterias se muestra en la Tabla 1, en la cual se observó que el medio de cultivo no
afecta la lectura de la concentración. Las características más importantes
determinadas de la bacteria que serviría de presa incluyen el diámetro y el tamaño
como se muestra en la Tabla 2.
Fagocitosis en Acanthamoeba.
8
Pertuz Belloso et al.
Figura 1. Curva de crecimiento de Klebsiella aerogenes. El
crecimiento bacteriano fue realizado de acuerdo a materiales y
métodos.
Tabla 1. Lecturas de absorbancia del medio de cultivo sin bacteria.
Longitud de onda
(nm)
Unidades arbitrarias de
absorbancia
500
0.028
520
0.022
540
0.017
420
0.00 1
La Tabla 2 muestra la morfometría de las bacterias usadas para todos los
bioensayos y la concentración estándar que se cosechó a partir del cultivo. K.
aerogenes, bacilo mesolítico perteneciente a el Phylum proteobacteria, que fue usado
como presa para los ensayos de fagocitosis de Acanthamoeba del Valle del
Mezquital.
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9
Tabla 2. Características de Klebsiella aerogenes teñidas con DTAF.
Parámetro
Características
Concentración
cosechada
10
8
a 10
9
bac/ml
Diámetro
promedio
1.31 µm ± 0.17 µm.
Tamaño
promedio
2.2 µm ± 0.9 µm
Forma
Bacilo
La curva de crecimiento de las especies de A. culbertsoni y A. castellanii mostró
una fase exponencial a los 2 días, con el mayor crecimiento alcanzando de hasta 25
millones de trofozoítos, una fase de meseta del crecimiento después de los 2 días y
una fase estacionaria a partir de los 4 días, en la cual el número de trofozoítos bajó
hasta 5 millones (Fig. 2).
30000000
25000000
20000000
15000000
10000000
5000000
0
1 2 3 4 5
Tiempo (Días)
Figura 2. Curva de crecimiento de Acanthamoeba. Los cultivos fueron
observados y cuantificados por más de 5 días hasta llegar al punto máximo de
crecimiento de acuerdo a materiales y métodos.
Concentración Cel s/m
Fagocitosis en Acanthamoeba.
10
Pertuz Belloso et al.
El análisis de patogenicidad mostrado en la Tabla 3 presentó a A. castellanii, como
la más patogénica. Como se puede observar en esta tabla, la recuperación de los
trofozoítos de Acanthamoeba de los órganos fue un indicador de patogenia. Los
trofozoítos fueron recuperados principalmente del cerebro y los pulmones, de acuerdo
a su grado de patogenicidad. A. castellanii del Valle del Mezquital, fue patogénica de
acuerdo a la recuperación de los trofozoítos en los órganos: Cerebro, pulmón, hígado
y riñón, tras un periodo de inoculación de los ratones de 9 días, momento en el cual se
presentaron síntomas de la infección. La recuperación de los trofozoítos de
Acanthamoeba fue observada a los 3 días, luego de su incubación sobre agar no
nutritivo en placas de Petri. Un parámetro observado fue la formación de halos
alrededor de los órganos infectados. Las otras dos especies, incluyendo A. culbertsoni
de referencia, no fueron positivas en estas pruebas de patogenicidad.
Tabla 3. Patogenicidad de Acanthamoeba castellanii.
Órganos/Ratones
Recuperación de trofozoítos de
órganos/Pulmón, cerebro
1
Negativo
2
Positivo*
3
Negativo
4
Negativo
5
Positivos*, **
*Los trofozoítos de estos órganos fueron utilizados para los bioensayos.
** Ratones sacrificados a los 9 días de la inoculación.
Microfotografías de los quistes y trofozoítos de las cepas aisladas del Valle de
Mezquital se presentan en la Figura 3. Para este estudio solo se probaron las cepas de
A. culbertsoni y A. castellanii. De acuerdo a las observaciones A. castellanii presentó
un quiste con exoquiste con un patrón de malla y grueso, y un endoquiste de forma
más o menos esférica, conectados por pequeños conos con el exoquiste. El tamaño
promedio del quiste fue de 14 µm. El trofozoíto de A. castellanii fue de 20 a 31 µm,
en promedio. A. culbertsoni, por su parte presentó un quiste de 15 µm y un trofozoíto
de entre 20 a 33 µm.
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Figura 3.
Quistes y trofozoítos de especies de Acanthamoeba
provenientes del Valle del Mezquital.
A-C
. Quistes de
Acanthamoeba. Preparaciones en fresco (Microscopio standard
Zeiss a 40x y 100x y Microscopio de inversión Zeiss).
D
.
Trofozoítos de Acanthamoeba en preparaciones en fresco, usando
contraste por Normasky (Microscopio standard Zeiss).
Aumento1000x.
A
0.001 mm
B
0.001 mm
C
0.001
Fagocitosis en Acanthamoeba.
12
Pertuz Belloso et al.
La fagocitosis de A. castellanii fue analizada sobre placas de agar no nutritivo,
que corresponden a medios sólidos, que emulan a la superficie en la que las
amebas crecen. Las características de la fagocitosis amebiana pueden verse en la
Tabla 4. La fagocitosis ocurre cuando las condiciones como la concentración de
los trofozoítos supera 1 x 10
6
cels ml-1 y 1 x 10
6
bac ml-1 de FLB. En
condiciones en las que las bacterias superan el orden de 10
9
bac ml-1 de FLB,
típicamente formando flóculos (Condición experimental 2, Tabla 4), las amebas
de vida libre fagocitan, y hasta el orden de 10
5
bac ml-1, como una condición
mínima en la que la fagocitosis de las amebas de vida libre puede ocurrir. Por
debajo de un millón de trofozoítos de Acanthamoeba no se observa la fagocitosis
(Condición experimental 4, Tabla 4).
Tabla 4.
Fagocitosis de Acanthamoeba castellanii.
Condiciones
Experimentales
Acanthamoeba
FLB
Klebsiella
aerogenes
(ATCC13048)
Observaciones
1
1 x 10
6
cels/ ml
1 x 10
6
bac/ ml
Ingiere
2
5 x 10
6
cels / ml
2 x 10
9
bac/ml
Ingiere
3
9 x 10
6
cels/ ml
1 x 10
5
bac/ml
Ingiere
4
5 x 10
5
cels/ ml
1 x 10
7
bac/ ml
No ingiere
5
5 x 10
5
cels/ml
2 x 10
7
bac/ ml
No ingiere
A
0.001mm
B
0.001 mm
C
0.001 mm
D
0.001 mm
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Figura 4.
Fagocitosis de Acanthamoeba culbertsoni de aguas
subterráneas del Valle del Mezquital.
A
y
C.
Trofozoítos teñidos con
DAPI (450/50 nm).
B
y
D
. Trofozoítos en 517 nm del canal correspondiente,
mostrando vacuolas con bacterias ingeridas marcadas con DTAF (Aumento
1000x).
B
. Vacuolas mostrando bacterias ingeridas a ½ de hora de la
fagocitosis.
D
. Vacuolas mostrando bacterias ingeridas a 1 hora de la
fagocitosis. Flechas señalando vacuolas con FLB.
Fagocitosis en Acanthamoeba.
14
Pertuz Belloso et al.
Las Figuras 4B y D muestran los trofozoítos con vacuolas conteniendo bacterias
ingeridas. El número de vacuolas en promedio por ameba fueron 5 vacuolas llenas y
un tope máximo de 12 vacuolas que comúnmente fue observado a la ½ hora (Fig. 4
D). La Figura 4 (B) muestra un trofozoíto con 12 vacuolas, solo una de ellas llena de
FLB, a 1 hora. Las Figuras 4 (A y C) muestran trofozoítos teñidos con DAPI
mostrando cambios en la morfología.
La Figura 5 muestra las etapas que fueron observadas en el estudio de la fagocitosis
de A. culbertsoni del Valle del Mezquital. La Figura 5A muestra un trofozoíto teñido
con DAPI. La Figura 5 B muestra un trofozoíto con vacuolas fagocíticas conteniendo
FLB (Flechas) a la ½ hora de incubación. La Figura 5 C muestra la formación de una
copa fagocítica, en la cual se depositan los flóculos de FLB (Flechas), en tiempos
cortos. En las Figuras 5 E y F se observan la copa fagocítica con mejor resolución, en
las cuales se puede observar la formación inicial de la copa fagocítica (Figura 5 E,
Flechas), en tiempos cortos. En la Figura 5 D, se observan trofozoítos con vacuolas
fagocíticas a tiempos largos, en las cuales ya no es posible observar las vacuolas con
FLB a 1 hora, solo se observan vacuolas formadas, en proceso de digestión del
material (Flechas).
El contenido vacuolar se presenta en la Tabla 5, en la cual observamos que A.
castellanii ingirió más FLB que la cepa A. culbertsoni. A la ½ hora el contenido
vacuolar fue mayor que a 1 hora de incubación con FLB, presentando mayor número
de vacuolas ingeridas. Un máximo de 5 vacuolas fue observado en este tiempo con
material ingerido. Las FLB fueron digeridas a 1 ½ hora, tiempo en el cual se observan
vacuolas con material no digerido. El mayor contenido vacuolar fue observado en A.
castellanii del Valle del Mezquital indicando un contaje de más 16.000 FLB por
vacuola a ½ de hora, con respecto a la hora o a la 1 ½ hora de incubación. Estas
diferencias fueron estadísticamente significativas (p≤0.05), como lo muestra la
Figura 6.
La cuantificación de la fagocitosis fue determinada en histogramas de intensidad de
la señal de fluorescencia, de acuerdo al fluorocromo usado para este estudio. El
histograma mostrado en la Figura 7A representa el análisis de los niveles de
fluoresceína en un trofozoíto marcado con DAPI, y las vacuolas conteniendo
bacterias marcadas con DTAF en un modelaje tridimensional. La Figura 7A muestra
el pico de fluorescencia a 495 nm, en la cual se observa el contenido de las vacuolas
con FLB, con
picos diferentes, que indican bacterias ingeridas.
En la Figura 7B
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podemos observar los histogramas en los canales adecuados. La tinción de las
bacterias marcadas ingeridas por las amebas se encontró en el canal verde en
donde se tiene la señal máxima que coincide de DTAF, indicando la ingestión de
FLB (Fig. 7 B, histograma del centro). Otras señales menos preponderantes se
pudieron registrar sin ningún cambio en la lectura de las bacterias ingeridas (Fig.
7 B, histograma canal azul e histograma canal rojo, del espectro luminoso). La
señal en el canal verde donde podemos detectar bacterias marcadas con DTAF
tiene una media 32.89 de unidades arbitrarias de fluorescencia, que es equivalente
al espectro de la Fluoresceína.
Una señal importante la observamos en el canal rojo del espectro de luz que
corresponden a 650 nm con un pico de fluorescencia de 23.34 de unidades
arbitrarias de fluorescencia, correspondientes también a vacuolas con bacterias
ingeridas por Acanthamoeba. El canal azul del espectro de luz de entre 359 nm de
excitación a 457 nm de emisión, correspondiente al DAPI no presentó señal
alguna, asegurando que el material ingerido pertenece a FLB (Fig. 8 B, parte
inferior del gráfico). La cuantificación de la señal de DAPI usada para detectar
las amebas fue también determinada en histogramas. El histograma (Fig. 8 A)
muestra que la señal máxima se encontró entre 300 nm a 400 nm con más de 100
unidades arbitrarias de fluorescencia. Los histogramas que muestran el merge o la
localización de las señales, observamos el desplazamiento de la intensidad de
señal de fluorescencia en el canal verde que forma parte de las señales de luz de
los fluorocromos de Isotiocianato (Figs. 8 B y C).
La mayor intensidad de fluorescencia fue en el rango de entre 359 nm a 400
nm, con un pico de fluorescencia a 300 nm del espectro de luz. A esta longitud de
onda se observaron picos que coinciden con las bacterias teñidas, con una
intensidad de fluorescencia de 150 unidades arbitrarias. Los histogramas muestran
mayor intensidad de fluorescencia en el canal verde del espectro de luz sobre los
450 nm. Un número de eventos o bacterias contenidas en las vacuolas fue de
244,080 unidades arbitrarias de fluorescencia. La marca de DAPI en el canal azul
alcanzó una media de 0.80 unidades arbitrarias de fluorescencia, que constituye el
marcaje sin bacterias. Los histogramas muestran que el pico de fluorescencia se
desplazó cuando se detectan las bacterias marcadas con DTAF (Figs. 8 B y C),
en 160 unidades arbitrarias entre 400 a 500 nm (Fig. 8A).
Fagocitosis en Acanthamoeba.
16
Pertuz Belloso et al.
Figura 5. Señal de DTAF en la fagocitosis de Acanthamoeba castellanii de
aguas subterráneas del Valle del Mezquital. A. Trofozoítos en el canal azul. B-
F. Trofozoítos en el canal verde usando apagamiento con Azul Tripano. B.
Vacuolas con FLB (Flechas). C. Copa fagocítica conteniendo un bloque de FLB
(Flechas). D. Vacuolas de ingestión (Flechas). E. Formación de la copa fagocítica
(Flechas). F. Copa fagocítica (Flechas). Aumento 1000x.
E
0.001 mm
F
0.001mm
D
0.001 mm
B
0.001mm
C
0.001mm
A
0.001mm
*
***
**
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Tabla 5. Contenido de FLB/vacuola fagocitada por cepa de Acanthamoeba.
Cepa
Vacuola 1
Vacuola 2
Vacuola 3
Vacuola 4
Vacuola 5
A. culbertsoni
5184
6088
ND*
ND
ND
A. castellanii
Mezquital
12080
16484
ND
ND
ND
A. castellanii
Mezquital ( ½ h FLB
digerida)
1648
1648
ND
ND
ND
A. castellanii
Mezquital (FLB
digerida)
(1 ½ h)
730
730
690
ND
ND
A. castellanii
Mezquital (FLB
digerida)
(1 h)
2168
4153
1988
5184
5184
*ND: No determinado
Figura 6.
Señales de fluorescencia del contenido vacuolar. A. castellanii
(Valle Me) incubada ½ de hora con FLB.
A. castellanii (FLB Dis) FLB
digerido incubada a 1 ½ de hora con FLB. A. castellanii incubada 1 hora. *, **,
***p≤0.05 diferencias significativas.
Fagocitosis en Acanthamoeba.
18
Pertuz Belloso et al.
B
Figura 7.
Histograma de las señales de la fluorescencia en los diferentes
canales de detección.
A
. Análisis de la intensidad de fluorescencia en 3D
mostrando un trofozoíto en el canal verde del espectro de luz que detecta
fluorocromos tipo Isocianatos. La intensidad es alta en el núcleo y las
intensidades de las bacterias teñidas con DTAF (Excitación 498 nm y Emisión
517 nm, Flechas).
B
. Histograma de fluorescencia. Pico de fluorescencia en el
canal verde coincidiendo con las bacterias teñidas DTAF.
A
Unidades
arbitrarias
de
fluorescencia
Escala del espectro de luz
A
Intensidad
de
fluoresceína
(Unidades
Arbitrarias)
B
C
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19
Figura 8.
Histograma de las señales de la fluorescencia en los
diferentes canales de detección.
A. Análisis de la intensidad de
fluorescencia en 3D, mostrando un trofozoíto en el canal azul del espectro
de luz que detecta fluorocromos tipo Fenil-indol. La intensidad es alta en el
núcleo y las intensidades sobre el núcleo con DAPI fueron detectadas a
Excitación 359 nm y Emisión 457 nm.
B
y
C
. Histograma de fluorescencia
(Merge). Pico de fluorescencia en el canal azul coincidiendo el núcleo y
probables endosimbiontes.
DISCUSIÓN
La fagocitosis en las especies de Acanthamoeba del Valle del Mezquital se
activa si la concentración de las amebas es mayor a 1 x 10
6
cels ml-1, y si las
bacterias tienen una concentración mayor a 1 x 10
8
cels ml-1, principalmente en
flóculos. Otra condición que presentó en este trabajo fue que los ensayos de
Fagocitosis en Acanthamoeba.
20
Pertuz Belloso et al.
fagocitosis deben de ser realizados sobre superficies, y con un mínimo
indispensable de concentración bacteriana.
Si bien, la fagocitosis fue realizada desde la cinética de los eventos de
ingestión de bacterias, no cabe duda de que la fagocitosis en las Acanthamoeba
ambientales probadas en este estudio está regulada por el sistema vacuolar y
compartimientos celulares asociados, los que permiten este mecanismo, que no
solo está asociado a la tasa de regulación de la población bacteriana, sino que
tiene un importante impacto sobre los ensamblajes ambientales.
A. castellanii proveniente del Valle del Mezquital reveló características de la
fagocitosis en las especies de Acanthamoeba y que poco han sido estudiadas. Tras
la técnica del apagamiento con buffer de azul tripano-PBS1x, se pudo observar el
contenido de las vacuolas de los trofozoítos, y las fases por las que se produce la
fagocitosis de las bacterias. Inicialmente, los trofozoítos de Acanthamoeba
forman una copa, en la cual se colectan bacterias desde los primeros 5 minutos.
Una proyección de trofozoítos mostró la formación de la copa de fagocitosis o
copa fagocítica cuya función fue colectar bacterias. Más específicamente, los
pseudópodos formados pueden colectar flóculos de bacterias que fueron
importantes para la fagocitosis del género Acanthamoeba.
Rogerson et al. (1996) encontraron similarmente que la misma superficie de
los trofozoítos de las especies de Gymnamoeba son suficientes para atrapar las
bacterias en especies de amebas de vida libre marinas. En este caso también se
observó la adhesión de las bacterias a la superficie celular.
La formación de copas fagocíticas u otras formas de captura de bacterias ha
sido reportado también para la toma de Legionella pneumophila por A.
castellanii, que forma un seudópodo superenrollado, que aparentemente es
inducido por la interacción específica con esta bacteria patógena (Bozue y
Jhonson 1996). Sin embargo, existen pocos registros de este proceso de
englobamiento de las bacterias en las fases iniciales de la fagocitosis.
Nuestro estudio muestra la formación de una copa fagocítica, un rearreglo de
seudópodos que facilita la captura de bacterias, un hallazgo importante de este
trabajo que constituye un aporte en la interacción de especies de Acanthamoeba
en el ambiente. La mayoría de los trabajos están concentrados en el estudio de la
fagocitosis o toma de bacterias, principalmente patógenas, como la mencionada
Legionella pneumophila, un patógeno que provoca una enfermedad respiratoria
Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas
Vol. 55. Nº 1, Enero- Junio 2021, Pp. 1-28
21
grave. Uno de los trabajos mencionados anteriormente muestra el arreglo de
seudópodos de una manera especial enrollándose para la toma de la bacteria e
ingerirla, al parecer este mecanismo esta propiciado por la bacteria, posiblemente
inducido por la combinación de carbohidratos, lipopolisacaridos,
oligolipopolisacaridos en la superficie bacteriana (Bozue y Johnson 1996, Seeger
et al. 2010, Alibaud et al. 2014).
Existen varios procesos que caracterizaron a la fagocitosis de las amebas de
vida libre del Valle del Mezquital, entre ellos, la formación de vacuolas
fagocíticas a la ½ hora y la reducción del contenido de estas vacuolas a 1 hora.
Durante una hora el contenido de las vacuolas fagocíticas es degradado o
expulsado, quedando solo las sustancias no digeribles. Principalmente, en este
estudio se encontró que la fagocitosis de las especies de Acanthamoeba
ambientales se caracterizó por el rearreglo de seudópodos para la formación de un
copa o cesta fagocítica, especialmente en A. castellanii.
Resultados similares fueron observados por Dey et al. 2019 para otras especies
del género Acanthamoeba, como, es el caso de A. polyphaga y la fagocitosis
Pseudomonas aeruginosa, una bacteria patógena; en la cual se observó la unión
inicial de estas bacterias a la superficie de la Acanthamoeba y luego la
internalización de las mismas en una relación de tiempo semejante a la encontrada
en este trabajo, durante la cual, el número de bacterias adheridas a la superficie
amebiana disminuyen, mientras que las bacterias se localizan en vacuolas luego
de 1 h. Contrariamente a nuestro trabajo, Dey et al. (2019) observaron que el
porcentaje de fagocitosis es mayor a los 1½ hora, mientras que nuestro trabajo el
mayor índice de fagocitosis se encontró a ½ hora, pero la diferencia estriba en las
bacterias o presas, una patogénica y la otra ambiental no patogénica. Para Bozue
y Johnson 1996 la cepa bacteriana patogénica, como Legionella pneumophila, no
sigue el tráfico de la fusión fagosoma-lisosoma, sino que se queda en el
citoplasma de Acanthamoeba e incluso este tipo de bacterias puede replicarse en
el mismo a diferencia de una bacteria ambiental que funciona como una presa.
El contenido vacuolar de las especies de Acanthamoeba del Valle del
Mezquital alcanzó
un máximo de 12.000 bacterias, de acuerdo a la intensidad de
fluorescencia, que en comparación con A. culbertsoni de referencia es más alto,
mostrando la importancia que tiene el género de Acanthamoeba en la regulación
de la población bacteriana.
La formación de vacuolas es un punto que debe de ser
es
Fagocitosis en Acanthamoeba.
22
Pertuz Belloso et al.
un punto que debe de ser estudiado en este género, pero resultados preliminares en
otros protozoarios, como Entamoeba histolytica demuestran que la interacción pre-
fagocítica ocurre vía complejos de proteínas con un receptor blanco que genera la
formación de vacuolas, provocando la activación del retículo endoplasmático, bien
para generar más proteínas de docking o bien para procesar el material ingerido; a
través de la fusión de los fagosomas con lisosomas, en un proceso que se ha
denominado una “digestión celular” (Pertuz Belloso Silvana, comunicación personal,
Berón et al. 1995, Siddiqui y Khan 2012, Hartenstein y Martínez 2019). Este proceso
se considera un mecanismo evolutivamente conservado desde los protozoarios hasta
algunas de las células del sistema inmunológico de los mamíferos (Hallett 2020).
Los efectos de las especies de Acanthamoeba sobre las poblaciones bacterianas
fueron descritos por Weekers et al. (1993), el crecimiento de las amebas de vida libre
fue indicador del consumo de las bacterias. Los cultivos de A. castellanii, H.
vermiformis y A. polyphaga (aisladas de suelo), se incubaron con varias bacterias
presentes en el ambiente, y se encontró que dependiendo de las especies de
Acanthamoeba, estas crecen y generan altos niveles de amonio. Una predisposición a
consumir enterobacterias fue observada para las amebas de vida libre se observó
cuando estas aumentaron su crecimiento y la producción de amonio, que fue el
indicador en este estudio. Similarmente a nuestro estudio, Weekers et al. (1993)
también encontraron que hay especies de Acanthamoeba que no son grandes
consumidoras de algunas de las especies bacterianas probadas, en el caso de este
estudio, A. culbertsoni del Valle del Mezquital no presentó una buena afinidad por la
enterobacteria seleccionada, la cual no ingiere bien.
El efecto que tiene la bacteria o presa en el crecimiento de las cepas de A.
castellanii o lo que es la preferencia por un tipo específico de bacterias fue también
observado por Pickup et al. 2007, haciendo pruebas con diferentes bacterias, de las
cuales K. aerogenes, y E. coli fueron las presas que generan mayor crecimiento de A.
castellanii y de H. vermiformis, demostrando con esto que existe una “preferencia”
por algunos tipos de bacterias, similarmente a nuestro estudio.
En un modelo de biopelículas, como son los lentes de contacto, Bottone et al.
(1992) encontraron un ensamblaje constituido por especies de Acanthamoeba spp.
y Xathomonas maltophila, Pseudomonas paucimobilis, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Flavobacterium breve y Escherichia coli.
Estas
bacterias incubadas con A. castellanii y A. polyphaga indujeron el crecimiento de
las mismas con preferencias de acuerdo a la especie bacteriana.
P. paucimolibis y
Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas
Vol. 55. Nº 1, Enero- Junio 2021, Pp. 1-28
23
X. maltophila indujeron un mayor crecimiento de A. castellanii. En cambio, A.
polyphaga creció mejor con la bacteria Flavobacterium breve, Staphylococcus
aureus y X. maltophila; mostrando que las diferentes cepas de Acanthamoeba
desarrollan una afinidad por algunas cepas bacterianas dependiendo del
ensamblaje de donde se hayan aislado.
En este caso se usó Klebsiella aerogenes, debido a su relación con el cultivo
para el aislamiento de estas especies de Acanthamoeba de las aguas subterráneas
del Valle del Mezquital. De acuerdo a las observaciones de Matuz (2001), existe
contaminación con aguas residuales que permean a las aguas subterráneas,
encontrando hasta 250 unidades formadoras de colonias de coliformes fecales,
indicando que en el lugar de aislamiento de las especies de Acanthamoeba
crecieron e interaccionaron con enterobacterias.
Varias han sido las bacterias que se han encontrado que son fagocitadas por las
especies de Acanthamoeba muchas de ellas patogénicas, tal es el caso de Yersinia
enterocolitica y Micobacterium leprae, en ambos casos estas bacterias son
fagocitadas, pero no digeridas, sino que por el contrario se replican en el
citoplasma de las amebas de vida libre, por lo que la función de la fagocitosis no
solo tiene que ver con ingesta de bacterias, sino que también tiene que ver con el
proceso de endosimbiosis y en muchos casos se han considerado a las especies de
Acanthamoeba como reservorios de bacterias patógenas, y podría redefinir las
condiciones de las enfermedades reemergentes (Lambrecht et al. 2013,
Guimaraes et al. 2016, Paling et al. 2018).
Desde el punto de vista ecológico, las amebas de vida libre del género
Acanthamoeba tienen importancia en la regulación de las poblaciones bacterianas
en biopelículas. Las biopelículas y los ensamblajes de microorganismos formados
sobre interfaces entre la columna de agua y sedimentos, así como en el suelo;
suelen ser ecosistemas en donde las amebas de vida libre son los principales
controladores de las poblaciones bacterianas. En
el caso específico de A.
castellanii se encontró que juega un papel importante sobre los ensamblajes de
las biopelículas integradas incluso por ciliados (Valster et al. 2011).
Efectivamente, las biopelículas en lentes de contacto son buenos ejemplos del
ensamblaje de organismos que componen estos ecosistemas. En el caso específico
de las especies de
Acanthamoeba en estas biopelículas contribuyen grandemente
Fagocitosis en Acanthamoeba.
24
Pertuz Belloso et al.
al soporte de las poblaciones bacterias en estas superficies. Miyazaki et al. 2020
observaron que el establecimiento y el crecimiento de la comunidad bacteriana
depende directamente de Acanthamoeba spp. Bacterias como Bacillus, Serratia,
Pseudomonas, Acinetobacter y Micrococcus, entre otras fueron encontradas en este
tipo comunidades, las mismas que han sido referidas como bacterias que comúnmente
son fagocitadas por las especies de Acanthamoeba.
En sistemas de suelo, las amebas de vida libre fueron capaces de depredar
bacterias reduciendo y regulando su población. Las especies bacterianas que han sido
reportadas para los ensamblajes, en donde han sido aisladas las amebas de vida libre,
son principalmente de los géneros Pseudomonas, Xanthomonas, Enterobacterias,
como la probada aquí y Legionella, una cepa patogénica; convirtiéndolas en
ocasiones en un reservorio de estas bacterias patogénicas (Guimaraes et al. 2016,
Andersen 2018).
Por último, desde el punto de vista de la biodiversidad de las aguas subterráneas
del Valle del Mezquital, el mayor porcentaje de las amebas de vida libre aisladas
fueron del género Acanthamoeba (Matuz 2001). Aquí en este estudio analizamos dos
cepas de este género que, de acuerdo al perfil, eran patogénicas, como fue descrito
anteriormente. En este estudio solo A. castellanii fue patogénica de acuerdo al ensayo
en ratones. Un punto importante fue que estas cepas crecieran en un rango de 22°C a
37°C; un rasgo de las cepas no patogénicas (De Jonckheere 1980). En este estudio
solo A. castellanii fue recuperada de pulmones, y el cerebro en ratones inoculados,
encontrando una relación entre la alta actividad fagocítica y la patogenicidad,
acotando que A. castellanii presentó mayor actividad fagocítica, con respecto a A.
culbertsoni, ambos aislados del Valle del Mezquital.
CONCLUSIONES.
Uno de los principales hallazgos de este trabajo fue la formación de la copa
fagocítica, así
como la determinación de que el evento de fagocitosis está limitado
por el tiempo de la ingestión del contenido vacuolar. A la formación de la copa
fagocítica le siguen la producción de varias vacuolas, y luego la posterior digestión
del contenido vacuolar. Las condiciones de la fagocitosis de estas cepas fueron de al
menos 1 millón de trofozoítos por milímetro cuadrado y al menos un millón de
bacterias.
Las mejores condiciones para que ocurra la fagocitosis son la saturación del
sistema con bacterias y emulación de la superficie o las interfases, en donde
Acanthamoeba ejerce una función importante.
Boletín del Centro de Investigaciones Biológicas
Vol. 55. Nº 1, Enero- Junio 2021, Pp. 1-28
25
AGRADECIMIENTOS.
A María Elena Martínez de la FES-Iztacala UNAM por la asesoría técnica en
la ejecución del marcaje de las amebas de vida libre en el sistema de
microfiltración.
A Patricia Chalico y Blanca Martínez de la FES-Iztacala UNAM por la
donación de las cepas de ameba de referencia y el cultivo bacteriano de
referencia.
A María del Rosario Sánchez y Alfonso Lugo de la FES-Iztacala UNAM por la
asesoría técnica en la toma de las microfotografías.
A Lourdes Massieu del Instituto de Fisiología Celular y Carlos Eslava de la
Facultad de Medicina. UNAM por su apoyo en la infraestructura.
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