Depósito Legal ppi 201502ZU4668
Vol. 26, No 1, 2
Enero - Junio 2018
An International Refereed Scientic Journal
of the Facultad Experimental de Ciencias
at the Universidad del Zulia
Esta publicación cientíca en
formato digital es continuidad
de la revista impresa
Depósito Legal: pp 199302ZU47
ISSN: 1315-2076
Scientic Journal from the Experimental Faculty of Sciences,
at the Universidad del Zulia Volume 26 Especial N° 1, 2, Enero - Junio 2018
Caracterización de fagos líticos-especícos de Pseudomonas
aeruginosa con un amplio espectro infectivo
Lenin González-P
1
*, Carla Lossada
3
, Gabriela Galué-Durán
1
, Irene Zabala
1
,
Aleivi Pérez
2
, Ysaias Alvarado
3
1
Laboratorio de Genética y Biología Molecular (LGBM). Departamento de Biología, Facultad Experimental
de Ciencias (FEC). La Universidad del Zulia (LUZ). Maracaibo, Venezuela.
2
Laboratorio de Microbiología General. Departamento de Biología, FEC-LUZ.
3
Laboratorio de Caracterización Molecular y Biomolecular (LCBM) IVIC-Zulia. Maracaibo, Venezuela.
Recibido: 18-12-2017 Aceptado: 30-01-2018
Resumen
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista, multirresistente frente a la acción de varios
antibióticos, por lo que se hace necesario considerar alternativas antipseudomónicas entre las que se incluye
la utilización de fagos. Estos han sido aprovechados para el control de patógenos. En este trabajo se evaluó la
actividad antagónica in vitro de bacteriófagos obtenidos de 50 muestras de agua residual doméstica del estado
Zulia sobre P. aeruginosa. Las muestras se pre-enriquecieron, y los sobrenadantes se ltraron, puricaron
y almacenaron. La detección de fagos se realizó por doble capa de agar. Se utilizó la cepa P. aeruginosa
ATCC®27853 como hospedero, y microorganismos Gram positivos y Gram negativos para establecer perl
infectivo. Se evaluó el ciclo biológico y estabilidad a variaciones de pH y temperatura de los fagos. Se detectaron
fagos antipseudomónicos en 60% de las muestras. El 85% de los aislados logró infectar todas las cepas de P.
aeruginosa. El 80% de los fagos fueron adsorbidos en <10min tras ser expuestos frente al hospedero. Los fagos
resultaron estables a diversos intervalos de pH y temperatura. Los fagos resultaron líticos especícos, posibles
miembros del orden Caudovirales, y candidatos deseables para el desarrollo de agentes antagónicos frente a
patógenos multiresistentes como P. aeruginosa.
Palabras Claves: Pseudomonas aeruginosa, bacteriófagos, enzibióticos.
Characterization of lytic-specic phages of Pseudomonas aeruginosa with a broad
infective spectrum
Abstract
Pseudomonas aeruginosa is an opportunity pathogen that may become multiresistant to antibiotics.
Hence, it is necessary to consider alternative medical procedure using antipseudomonal agents like
bacteriophages. Their lytic enzymes with bactericidal actions have been widely utilized to control this type
of microorganisms. Screening of 50 samples of wastewater from of Zulia state was performed to evaluate
bacteriophages’ antagonistic activity on P. aeruginosa. The samples were pre-enriched and the supernatants
were ltered, puried and stored. Detection was performed by double layer agar. The strain P. aeruginosa
ATCC®27853 was used as a host, and several microorganisms, both Gram positive and Gram negative, were
used to establish infective prole. Antipseudomonic phages’ biological cycle and stability to pH and temperature
variations were evaluated. Antipseudomonic phages were detected in 60% of the samples. 85% of the isolates
managed to infect all strains of P. aeruginosa. 80% of the phages were adsorbed in <10min after being exposed
to the host. All phages were stable at various pH and temperature ranges. There were no apparent changes
in lysis plate morphology. The phages had characteristics that make them possible members of the order
Caudovirales and potential antagonistic agents against multiresistant pathogens such as P. aeruginosa
Key Words: Pseudomonas aeruginosa, bacteriophages, enzybiotics.
* lgonzalezpaz@gmail.com
CIENCIA 26 (1,2), 5 - 14, 2018
Maracaibo, Venezuela
6 Caracterización de fagos líticos-especícos de Pseudomonas aeruginosa...
Scientic Journal from the Experimental Faculty of Sciences,
at the Universidad del Zulia Volume 26 Especial N° 1, 2, Enero - Junio 2018
Introducción
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno
oportunista, prevalente en medios hospitalarios, el
cual llega a causar infecciones nosocomiales severas
al colonizar sistemas como el tracto respiratorio de
pacientes inmunocomprometidos, broquísticos o
con quemaduras severas [1]. Si bien los antibióticos
han contribuido a mejorar el pronóstico de estos
pacientes, su uso frecuente y prolongado ha sido
un factor importante en la selección de cepas de
P. aeruginosa multiresistentes [2]. El surgimiento
de cepas bacterianas resistentes a antibióticos ha
motivado la búsqueda de alternativas antagónicas,
con menos efectos secundarios y con una alta
especicidad para evitar perturbar la microbiota del
ser humano [3]. Una estrategia prometedora es el
uso de bacteriófagos (virus que infectan a bacterias)
y de sus derivados enzimáticos (enzibióticos).
Estos han sido descritos como potenciales
agentes antimicrobianos contra cepas bacterianas
multiresistentes a antibióticos, incluyendo a P.
aeruginosa [4-6]. Casi todos los estudios acerca de
fagos de P. aeruginosa han sido llevados a cabo con
muestras aguas residuales recolectadas del ambiente
y de hospitales en EEUU y en países de Europa,
Australia, Asia y África [4-5,7-10], existiendo muy
pocos reportes en Sudamérica relacionados a la
acción de fagos capaces de infectar diversas cepas de
P. aeruginosa, tanto sensibles como multiresistentes
a fármacos. Por lo tanto, el objetivo de este estudio
se basó en aislar y caracterizar fagos especícos de P.
aeruginosa multiresistentes a fármacos a partir de
muestras de aguas residuales para posteriormente
poner a prueba su potencial como alternativas
antimicrobianas.
Materiales y Métodos
1. Cepas bacterianas y condiciones de
crecimiento
Se estudió una cepa de P. aeruginosa de origen
clínico conrmada por el Laboratorio de Genética
y Biología Molecular (LGBM) de la Facultad
de Ciencias (FEC) de la Universidad del Zulia
(LUZ) como productora de metalo-β-lactamasas
(MBLs) de espectro extendido mediante métodos
fenotípicos y genotípicos. Además, las cepas de
referencia P. aeruginosa ATCC®27853 (usada
como hospedador) y P. aeruginosa ATCC®10145,
criopreservadas en el LGMB-FEC-LUZ a -20ºC en
caldo Tripticasa Soya (TBS) (Merck®, Alemania)
con un contenido de glicerol de 20% (Sigma, EUA).
2. Aislamiento, propagación y puricación
de los bacteriófagos de P. aeruginosa
Durante los meses de mayo-agosto del año
2017, se tomaron 50 muestras de agua residual
doméstica en la ciudad de Maracaibo, estado Zulia,
Venezuela. Se aislaron los fagos de las muestras
mediante la técnica de pre-enriquecimiento [11],
con modicaciones [12-13]. Se agregó 50mL de
medio TSB (Merck®, Alemania) a 50mL de la
muestra de agua residual doméstica, y se incubó
18-24h a 35±2ºC. Posteriormente fue ltrado
con membranas de 0,45μm y alícuotas de 1,4mL
fueron vertidas en tubos, a las cuales se le agregó
0,1mL de cloroformo (Sigma®, EUA). La solución
fue mezclada y centrifugada (10.000xg, 30min).
El sobrenadante se transrió en un tubo falcon. El
pellet fue resuspendido con 1,5mL de extracto de
carne (EC) al 3% (HIMEDIA®, India). La mezcla
fue centrifugada (5.000xg, 15min) y el sobrenadante
fue transferido de forma aséptica al tubo falcon
reservado. El sobrenadante se almacenó a -20ºC
por 24h. Posteriormente, la suspensión se pasó
por ltros de 0,2µm y se almacenó a 4ºC. Los fagos
fueron propagados y puricados a partir de aislados
de una sola placa según la metodología reportado
por El Didamony y col. (2015) y Ahiwale y col.
(2012) [4,9].
3. Preparación del lisado
Se transrió una placa (0,5-3mm de diámetro) a
50mL la solución estéril de fago con 0,5mL de cultivo
de P. aeruginosa en fase logarítmica. El matraz fue
cultivado a 37ºC por 24h sin agitar. Su contenido fue
centrifugado, ltrado a través de una membrana de
0,20μm y almacenado a 4ºC. Se utilizó la técnica de
doble capa de agar para calcular la concentración
(UFP/mL) [4,9].
4. Determinación del rango de
hospedadores de los bacteriófagos
Para determinar el rango de hospedadores se
empleó la técnica de doble capa de agar [5-10]. Se
utilizaron las cepas Staphylococcus aureus subsp.
aureus ATCC®25923, S. aureus ATCC®6538P, S.
aureus LGMB-MRSA, S. epidermidis ATCC®12228,
Enterococcus faecalis ATCC®29212, E. faecalis
LGMB-Q65, Micrococcus luteus ATCC®9341,
Escherichia coli ATCC®35218, E. coli LGMB-
ESBL, P. aeruginosa ATCC®10145, P. aeruginosa
ATCC®27853 y P. aeruginosa LGMB-MBL+.
Cada fago fue probado contra cada cepa bacteriana
por triplicado y en al menos tres experimentos
independientes. En base a la claridad de la zona
lítica, las placas fueron categorizadas como claras,
claras con halo o sin reacción. El tamaño y la
7González-P et. al.,/ Ciencia Vol. 26, Número Especial (2018) 5-14
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morfología de las placas de lisis obtenidas fueron
examinadas durante cada tratamiento distinto (pH
y temperatura) [9].
5. Efecto del pH en la estabilidad de los
bacteriófagos
La estabilidad de los fagos fue estudiada usando
buffer fosfato, con pH ajustado a 3, 4,5,6,8 y 9.
Alícuotas (1mL) de lisado (1,5x10
9UFP/mL
) fueron
suspendida en 9mL del buffer respectivo en tubos
de ensayo e incubadas por 2h. Los contenidos de
los tubos fueron diluidos en serie y las UFP/mL en
cada uno fueron determinadas por ensayo de placas
usando la bacteria hospedadora P. aeruginosa. Las
mediciones se tomaron cada 30min [9].
6. Efecto de la temperatura en la
estabilidad de los bacteriófagos
La estabilidad de los fagos fue evaluada a
diferentes temperaturas (25, 30, 35 y 40ºC),
incluyendo las de almacenado (-20º y -4ºC).
Alícuotas de 1mL de lisado (1,5x10
9UFP/mL
) fueron
colocada en tubos tapados estériles e incubadas
a su temperatura respectiva por 2h. Las UFP/mL
fueron determinadas de la manera mencionada
anteriormente [9].
7. Curva de crecimiento en un paso
La curva de crecimiento en un paso se determinó
de acuerdo al método de El Didamony y col. [4], con
algunas modicaciones. Los fagos fueron agregados
a un MOI<0,1 a las células de P. aeruginosa. La
mezcla fue centrifugada (10,000xg, 10min) y el pellet
con las células infectadas fue resuspendido en 10mL
de caldo nutritivo y fue incubado a temperatura
ambiente. Se tomaron muestras por duplicado cada
5min durante 1h, diluidas y tituladas mediante el
método de doble capa. El segundo set de muestras
fue tratado con cloroformo al 1% para liberar fagos
intracelulares para determinar el período de eclipse.
La mezcla de cada tubo de ensayo fue diluida en serie
en caldo EC y las UFP/mL fueron determinadas
como se mencionó anteriormente [9].
8. Cinética de adhesión de los
bacteriófagos
Fue introducido 1mL del cultivo en fase
logarítmica de la bacteria hospedadora [OD650
0.05, 2.8x10
9
UFC/mL] en un matraz estéril de
50mL y fue incubado por 24h a 37ºC. El lisado de
fagos (1,5x10
9
UFP/mL) fue agregado al matraz
(0.5mL, MOI<0.1). En intervalos de 5min durante
1h, alícuotas de 50μL fueron extraídas y transferidas
a tubos separados que contenían 950μL de lisado y
100μL de cloroformo. El contenido de los tubos fue
mezclado, diluido en serie en caldo EC y sembradas
en placas estériles. Se determinó el número de
placas después de 24h de incubación a 37ºC [4,9].
9. Análisis estadístico
Se llevaron a cabo cálculos porcentuales para
determinar la proporción de bacteriófagos de P.
aeruginosa encontrada por muestra analizada,
perles infectivos y rango de hospedadores. Se usó
como modelo estadístico ANOVA para observar
las diferencias entre la sensibilidad de las cepas
evaluadas versus el fago encontrado [10]. Se llevó
a cabo un análisis multivariado en InfoStat para
analizar las características de los fagos, además de
establecer asociaciones entre aspectos tales como
la morfología y el diámetro de las zonas de lisis,
mediante la prueba Chi-Cuadrado.
Resultados y discusión
1. Aislamiento, propagación y
puricación de los bacteriófagos de P.
aeruginosa
El 60% de las muestras (30/50) resultaron
positivas para el aislamiento de fagos. La media
de UFP/mL fue ≥30 aprox. en todas las muestras
evaluadas. Los resultados indicaron que el método
empleado basado en el pre-enriquecimiento de las
muestras y varias etapas de ltrado, presentó una
buena sensibilidad para el aislamiento de este tipo
de virus, arrojando porcentajes de aislamiento
similares a los reportados [13-15]. Es importante
señalar que la mayor parte de las investigaciones
se destinan al aislamiento y estudio de cepas de P.
aeruginosa en agua potable o dulce, por el importante
rol de este patógeno de interés clínico en este tipo
de muestras destinadas al consumo humano [16-
18]. Sin embargo, Knezevic y col. (2009) aislaron
fagos de P. aeruginosa en el 80% de las muestras
de aguas que evaluaron, usando de igual forma la
técnica de vertido en placa. En dicho trabajo, el 70%
de los bacteriófagos fueron aislados de agua dulce,
mientras que el 80% de las partículas virales fueron
obtenidas a partir de muestras de agua residual
doméstica, resultados mayores a los obtenidos en
este estudio. En Colombia, empleando de igual forma
métodos de cultivo in vitro inoculando las muestras
presuntivas de fagos, se han aislado ecientemente
bacteriófagos de P. aeruginosa a partir de muestras
ambientales diversas [19]. En Japón, se han aislado
fagos de la familia Myoviridae y un Siphoviridae
en muestras de agua con actividad lítica frente a
bacterias del género Pseudomonas, y empleados con
8 Caracterización de fagos líticos-especícos de Pseudomonas aeruginosa...
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nes terapéuticos mediante alimentos impregnados
con los mismos [20].
2. Determinación del rango de
hospedadores de los bacteriófagos
El 85% de los aislados (26/30) logró infectar
todas las cepas de P. aeruginosa probadas (Tabla
1). La sensibilidad de P. aeruginosa se ha descrito
frente a otros fagos de las familias Myoviridae y
Podoviridae. Los fagos de estas familias virales
capaces de infectar cepas de P. aeruginosa, ya se
ha reportado anteriormente [21-22]. Por otro lado,
el estudio del espectro de infección sobre diversos
géneros bacterianos, reveló una baja variabilidad,
obteniéndose cinco perles de infección para los
30 fagos estudiados (Tabla 1). Solo un 6% (2/30)
presentó actividad antagónica frente a la cepa S.
aureus ATCC®25923, y por lo tanto se excluyeron
de los ensayos posteriores. Este tipo de fagos,
sin embargo, podría ser utilizado en aplicaciones
tales como descontaminación de supercies o en
el tratamiento de infecciones superciales con
bacterias relacionadas [22]. El 10% (3/30) de los
fagos no fueron capaces de infectar a P. aeruginosa
MβL+ (Tabla 1), la cual es resistente a antibióticos del
grupo de los carbapenemas. Cabe mencionar, que la
resistencia de cepas MβL+ a fagos capaces de infectar
a P. aeruginosa ATCC®27853 y ATCC®10145,
puede estar relacionada, posiblemente, con la
ausencia de sitios de reconocimiento de los fagos,
puesto que el tipo de receptor de supercie varía
considerablemente entre bacterias Gram negativas.
Cuantas más moléculas pueda reconocer como
receptores, más amplio será el rango de huésped del
fago. El reconocimiento o no de los receptores de
la cepa huésped por parte del fago determinará la
eciencia de adsorción del fago, una mayor eciencia
de adsorción se observa con un mayor número
de bacterias infectadas [23]. Aunque estos virus
tengan una elevada anidad por sus receptores, se
ha reportado que la velocidad y la eciencia de la
adsorción son parámetros importantes que varían
en función de los factores externos y del estado
siológico del hospedadero. Esto explicaría que un
13% (4/30) de los aislados, no logró exhibir algún
tipo de actividad antagónica frente a por lo menos
una de las cepas de P. aeruginosa probadas, bajo
las condiciones establecidas en este estudio [23-24].
La resistencia de las variantes MβL+ también se
relaciona con el reciclaje del peptidoglicano, el cual
es una estructura de reconocimiento viral. Porque,
si bien existen fagos que producen proteínas que van
dirigidas a alterar la biosíntesis del peptidoglicano,
algunas no poseen actividad muraminidasa, por lo
que no tienen al ácido murámico como receptor de
supercie [23, 25]. Los sistemas CRISPR ( del inglés
clustered regularly interspaced short palindromic
repeats, en español repeticiones palindrómicas
cortas agrupadas y regularmente interespaciadas)
podría ser otra posible razón de la resistencia,
porque en la actualidad se sabe que luego de una
exposición viral inicial, las bacterias pueden ser
capaces de integrar en su genoma secuencias
derivadas del genoma del fago, lo cual permite a la
célula bacteriana reconocer posteriormente al virus
y expresar nucleasas para digerir el virus, y evitar la
infección [27-29].
Tabla 1. Especicidad y perl infectivo de los aislados bacteriófagos de P. aeruginosa obtenidos de
muestras de agua residual doméstica.
Aislado(s) Cepa(s)
Pseudo-
monas
aeru-
ginosa
ATCC
®
27853
Pseudo-
monas
aeru-
ginosa
ATCC
®
10145
Pseu-
domo-
nas
aeru-
ginosa
MβL+
Sta-
phylo-
coccus
aureus
ATCC
®
25923
Sta-
phylo-
coccus
aureus
ATCC
®
6538P
Sta-
phylo-
coccus
aureus
M03A-
07
Staphylo-
coccus
epidermi-
disATCC
®
12228
Entero-
coccus-
faecalis
ATCC
®
29212
Ente-
rococ-
cus-
faeca-
lis
Q65
Micro-
coccus-
luteus
ATCC
®
9341
Esche-
richia-
coli
ATCC
®
35218
Es-
cheri-
chia-
coli
BLEE
F1 + + + ND - - - - - - - -
F2 + + + - - - - - - - - -
F3 + + + - - - - - - - - -
F4 + + + - - - - ND - - - -
F5 + + + - - - - - - - - -
F6 + + + - - - - - - - - -
F7 + - + - - - - - - - ND -
F8 + + + - - - - - - - - -
F9 + + - +
†
- - - - - - - -
F10 + + + +
†
- - - - - - - -
9González-P et. al.,/ Ciencia Vol. 26, Número Especial (2018) 5-14
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3. Morfología de las placas de lisis y de los
bacteriófagos
El 60% (15/25) de los fagos mostraron una
morfología de las placas de lisis con un halo de lisis
alrededor de la calva. El resto mostró zonas de lisis
claras y denidas. Los tamaños de placa obtenidos
para cada fago se muestran en la Tabla 2. La
formación de halos es una característica deseable en
fagos elegidos como agentes terapéuticos dado que,
en diversos patógenos Gram negativos, la cápsula
está descrita como un factor de virulencia [32], y
se ha reportado que incrementa la adhesión de la
bacteria a determinadas supercies [33-34].
F11 + + + - - - - - - - ND -
F12 + + + - - - - - - - - -
F13 + + + - - - - - - - - -
F14 + + + - - - - - - - - -
F15 + + + - - - - - - - - -
F16 + + + - - - - - - - - -
F17 + + + - - - - - - - - -
F18 + + + - - - - - - - - -
F19 + + + - - - - - - - - -
F20 + + + - - - - - - - - -
F21 + + - - - - - ND - - ND -
F22 + + + - - - - - - - - -
F23 + + + ND - - - - - - - -
F24 + + + ND - - - - - - ND -
F25 + + + - - - - - - - ND -
F26 + + - - - - - - - - - -
F27 + + + - - - - ND - - - -
F28 + + + - - - - ND - - - -
F29 + + + - - - - - - - - -
F30 + + + - - - - ND - - - -
n° cepas
infectadas
30 30 27 2 0 0 0 0 0 0 0 0
†; lisis total (sombreado en azul), †; lisis turbia; -; sin lisis; ND; no determinado; controles positivos, ATCC®27853, ATCC®10145,
MβL+; controles negativos, ATCC®25923, ATCC®6538P, M03A-07, ATCC®12228, ATCC®29212, Q65, ATCC®9341, ATCC®35218 y
BLEE
Tabla 2. Tamaño y tipo de las placas de los aislados de bacteriófagos de P. aeruginosa.
Aislado Rango hospedero
Tamaño
de placa
(mm)
Tipo de placa
F1 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 1.0 – 2.0* Claras con halo
F2 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 1.0 – 3.0* Claras con halo
F3 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 1.0 – 1.5 Claras con halo
F4 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 0.5 – 1.5* Claras
F5 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 1.0 – 3.0* Claras con halo
F6 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 1.0 – 2.0* Claras con halo
F7 ATCC
®
27853 /MβL+ 0.5 – 1.0 Claras
10 Caracterización de fagos líticos-especícos de Pseudomonas aeruginosa...
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No se encontraron diferencias estadísticamente
signicativas (p>0,05) entre los tamaños de las
placas generadas con y sin la adición de MgSO
4
.
Sin embargo, con MgSO4 aproximadamente el
40% (10/25) de los fagos mostraron placas de lisis
signicativamente más grandes (p<0,05). Esto
puede deberse a que el MgSO4 facilita la adhesión
de algunos fagos a la bacteria huésped, y se ha
reportado la importancia de este tipo de cofactores
[22]. El análisis de correspondencia múltiple de
los 30 aislados arrojó tres grupos principales de
fagos, en función de la morfología de sus placas
(diámetro mínimo y máximo de los halos, y el tipo
de calva generada), y según el rango hospedero
previamente observado. Dichos grupos se muestran
en el dendrograma (Figura 1). El primero de ellos
englobaba a 11 aislados que infectaban únicamente
a cepas de P. aeruginosa, con las placas de lisis de
mayor tamaño, siendo estas ≥2mm de diámetro,
todos capaces de generar halos de inhibición
alrededor de las placas. El segundo grupo formado
por 16 fagos, incluyó a aquellos que no infectan a P.
aeruginosa, con placas de lisis de menor tamaño
(0,5–1,5mm) y sin halos; y el tercero, con tres fagos,
que sólo infectan a un pequeño porcentaje de cepas
de P. aeruginosa. Los fagos que con MgSO4 (16/25)
presentaron placas de lisis consideradas de menor
tamaño (64% de los aislados) fueron excluidos
del resto de los ensayos. Esto puede ser resultado
de períodos de latencia muy largos, tamaños de
explosión pequeños y/o baja tasa de adsorción de
los fagos a la bacteria hospedadora [35], o podrían
ser fagos temperados. Esta última posibilidad
concuerda con aislados con zonas de lisis turbias.
Luego del análisis de asociación entre estas
variables, con una signicancia del 5%, se encontró
que existió correlación entre el diámetro de las
placas de lisis y el tipo de placa observado, como lo
reportaron en 2005 por Guttman y col. [23]. Con
base a estos criterios, adicional a la inocuidad para
la microbiota humana, fueron seleccionados los
aislados especícos para P. aeruginosa F1,F2,F5,F6
y F8, como se recomienda [22, 36].
F8 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 1.0 – 3.0* Claras con halo
F9 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / ATCC
®
25923 0.5 – 1.0 Claras
F10 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ / ATCC
®
25923 0.5 – 1.0 Claras
F11 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 0.5 – 1.0 Claras
F12 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 0.5 – 1.0 Claras
F13 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 0.5 – 1.0 Claras
F14 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 0.5 – 1.0 Claras
F15 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 0.5 – 1.0 Claras
F16 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 0.5 – 1.0 Claras
F17 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 1.0 – 2.0* Claras con halo
F18 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 1.0 – 2.0* Claras con halo
F19 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 1.0 - 1.5 Claras con halo
F20 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 1.0 - 1.5 Claras con halo
F21 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 1.0 – 2.0* Claras con halo
F22 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 0.5 – 1.0 Claras
F23 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 0.5 – 1.0 Claras
F24 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 0.5 – 1.0 Claras
F25 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 1.0 – 2.0* Claras con halo
F26 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 1.0 – 1.5 Claras
F27 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 0.5 – 1.0 Claras
F28 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 0.5 – 1.0 Claras
F29 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 0.5 – 1.0 Claras
F30 ATCC
®
27853 / ATCC
®
10145 / MβL+ 0.5 – 1.0 Claras
ATCC, American Type Culture Collection; MβL+, productor de metalobetalactamasas; Sin MgSO
4
P
Value>0,05; *Con MgSO
4
P Value<0,05.
11González-P et. al.,/ Ciencia Vol. 26, Número Especial (2018) 5-14
Scientic Journal from the Experimental Faculty of Sciences,
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Figura 1. Dendrograma de los grupos de
fagos según el análisis de correspondencia
múltiple realizado con el programa
InfoStat.
4. Efecto del pH en la estabilidad de los
bacteriófagos
El aislado F2 presentó la media más baja de
calvas siendo este ≥18UFP/mL, mientras que el
aislado F8, mantuvo su conteo por encima de las
180UFP/mL. Entre los intervalos de pH 6 y 7, se
observó la mayor actividad en relación al recuento
del número de placas de lisis (≥100UFP/mL). A pH
4 y 9 se observó la mayor diferencia en la actividad
de los diferentes fagos, con un descenso en la
media ≥30UFP/mL (Figura 2A). No se detectaron
partículas virales a pH 3 o inferiores, ni por encima
de 9. Los fagos aislados de P. aeruginosa fueron
estables a la acidez (pH 4), y entre ellos, el fago
F8 resultó ser signicativamente más resistente
(p<0,05) que los otros dos. No se apreciaron cambios
en la morfología inicial de las placas presentadas por
cada uno de los fagos y los diámetros de las calvas
se mantuvieron con una media entre 1 y 2mm.
Es importante destacar que los aislados F5 y F6,
exhibieron a pH 6 placas de unos 3mm de diámetro,
mostrando un claro descenso, tanto a pH ácido como
básico, al igual que lo observado con el resto de los
aislados. Los resultados obtenidos concuerdan
con lo observado por otros autores que reportan
aislados de bacterias Gram negativas estables a pH
6, y diferentes sensibilidades de cada aislado a pH
4. Ningún aislado resistió valores de pH ≤3, al igual
que lo descrito en la familia Podoviridae [30], por
lo que, para la administración oral, los fagos deben
incluirse necesariamente en una matriz resistente al
ácido que funcione como vehículo, o disminuir de
alguna manera las condiciones extremas de acidez
del estómago, como con el uso conjunto de bases
débiles [22, 31].
5. Efecto de la temperatura en la estabilidad
de los bacteriófagos
La Figura 2B muestra los resultados obtenidos.
La media general obtenida fue de ≥60UFP/mL. El
mayor conteo de calvas se obtuvo en los intervalos
de temperatura de -20 a 25ºC, con una media mayor
a 80UFP/mL. Se observó una disminución del
número de calvas a partir de los 35-40ºC (≥30UFP/
mL). El aislado F8 fue el único que se vio mayormente
afectado a temperaturas ≥45ºC. Sin embargo, los
otros aislados (80%) presentaron de igual forma
una disminución en su actividad a partir de una
temperatura ≥40ºC. Solo el F1 mantuvo su conteo
por encima de las 100UFP/mL a temperaturas
≥40ºC, resultando ser signicativamente más
resistente (P<0,05) que los otros fagos a las
variaciones de temperatura por encima de los
35ºC.No se apreciaron cambios con relación a la
morfología inicial de las placas presentadas por
cada uno de los fagos. Es importante destacar que
los aislados F1, F2 y F5, exhibieron a temperaturas
≥40ºC placas de unos 3mm de diámetro.
A
B
Figura 2. Estabilidad a variaciones de pH y temperatura de bacteriófagos de P. aeruginosa
12 Caracterización de fagos líticos-especícos de Pseudomonas aeruginosa...
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Los resultados obtenidos de tolerancia en los
intervalos de -20 a 30ºC se corresponden con lo
reportado en la literatura, en la cual se describe que,
cuando se trabaja con bacteriófagos infectivos para
cepas Gram negativas, es muy común mantener
los lisados de fago bajo dichas condiciones,
especialmente a temperatura ambiente. Si bien se
espera que a mayor temperatura los procesos de
degradación afecten más a las partículas de fago,
el impacto de esta en la velocidad de inactivación
de las partículas es un factor que debe conocerse
para determinar qué tan estricto debe ser su control
durante el almacenamiento a largo plazo [22].Se ha
reportado que a temperaturas superiores a los 30ºC
los fagos de la familia Podoviridae, se degradan
velozmente, lo cual resulta similar a la tolerancia
exhibida por los aislados F2, F5, F6 y F8. El mayor
conteo de placas se obtuvo cercano a 25ºC para
4/5 de los fagos, y la disminución del número de
calvas de observó a partir de los 35ºC, parámetros
de tolerancia encontrados en aislados del orden
Caudovirales en miembros de la familia Podoviridae
[30]. Los resultados a -20°C concuerdan con lo
reportado [22].
6. Curva de crecimiento en un paso
Se observó que todos los fagos seleccionados
generaron placas de lisis a partir de los 5min con la
técnica de la curva de crecimiento en un paso o One-
step growth, encontrándose un porcentaje de células
infectadas con al menos una partícula viral, según la
distribución de Poisson de P(1)=~≥90% y una MOI
media ≥20. Exceptuando el fago F2, el cual inició
su ciclo infectivo a los 55min, con un P(1)=~80%, y
una MOI≥2 (Tabla 3). Los valores de k encontrados
fueron del orden de 10
-9
ml.UFC
-1min-1
, para fagos que
reconocen varios cientos de receptores celulares,
hasta valores del orden de 10-11ml.UFC
-1min-1
, para
fagos que reconocen 2 o 3 receptores por célula.
Las constantes de adhesión k, calculadas a partir de
las curvas de lisis en un ciclo obtenidas, fueron de
1,7x10
-7
ml.UFC
-1min-1
para los fagos F1, F5, F6 y F8, y
de 3,4x10
-9
ml.UFC
-1min-1
para el fago F2, lo que indica
una mayor velocidad de adhesión de los primeros.
Tabla 3. Parámetros del ciclo lítico de los fagos de P. aeruginosa.
Parámetro F1 F2 F5 F6 F8
Constante de adsorción (ml UFC
-1
min
-1
) 1,7x10
-7
3,4x10
-9
1,7x10
-7
1,7x10
-7
1,7x10
-7
Tiempo de eclipse (min) 4,5 ± 2,9 50,0 ± 2,0 4,5 ± 2,9 4,5 ± 2,9 4,5 ± 2,9
Tiempo de latencia (min) 5,0 ± 2,5 55,0 ± 2,0 5,0 ± 2,5 5,0 ± 2,5 5,0 ± 2,5
Tamaño de explosión (UFP/UFC)
500,0 ±
5,0
120,0 ±
5,0
1870,0 ±
5,0
370,0 ± 5,0 1870,0 ± 5,0
MOI ≥10 ≥2 ≥35 ≥7 ≥35
P(1) ~ ≥90% ~ 80% ~100% ~ ≥90% ~100%
MOI, multiplicidad de infección; P(1), distribución de Poisson; UFP, unidades formadoras de placas; UFC, unidades
formadoras de colonias.
7. Cinética de adhesión de los bacteriófagos
En las curvas de lisis el período de inicio de la
fase de eclipse fue de unos 14min, siendo el del fago
F2 el mayor (50min). Todos los fagos evaluados
presentaron un inicio de fase de latencia de
aproximadamente unos 15min, excepto para el fago
F2, cuya fase de latencia fue de 55min. El tamaño
de explosión calculado se generó a los 45±3min
de iniciada la infección, y fue de b=330UFP/UFC,
exceptuando para los aislados F5 y F8, los cuales
exhibieron un tamaño de máxima propagación de
b=≥1870 UFP/UFC (Tabla 3). El fago F2 fue el que
presentó el menor número de fagos producidos por
bacteria infectada (b=125UFP/UFC) y el mayor
periodo de tiempo para la explosión (60±5min).
En las cinéticas de adhesión de fagos líticos, la
representación del logaritmo de la fracción o del
porcentaje de fagos libres (no adheridos) respecto
al tiempo, correspondió a una recta de pendiente
negativa, cuya ecuación puede plantearse como log
P=logP
0
–kBt/2,3; donde P
0
es el número inicial de
partículas de fago, P el número de fagos libres (no
adsorbidos) al tiempo t, B es la concentración de
bacteria hospedadora, y k es lo que se denomina
constante de adsorción. Los valores de k encontrados
normalmente fueron del orden de 10
-9
ml.UFC
-1min-1
,
para fagos que reconocen varios cientos de receptores
celulares, hasta valores del orden de 10
-11
ml.UFC
-
1min-1
para fagos que reconocen 2 o 3 receptores por
célula [22]. Las constantes de adhesión k, calculadas
a partir de las curvas de lisis en un ciclo obtenidas,
fueron de 1,7x10
-7
ml.UFC
-1min-1
para los fagos F1, F5,
F6 y F8, y de 3,4x10
-9
ml.UFC
-1min-1
para el fago F2. Se
encontró que a los 5min de comenzada la infección,
quedó libre (sin adherir) una menor cantidad de
13González-P et. al.,/ Ciencia Vol. 26, Número Especial (2018) 5-14
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fagos en 4/5 de los aislados, en contra posición a
lo presentado por el fago F2, cuyo valor fue mayor.
Esto puede deberse bien sea porque, aunque todos
los aislados reconocen receptores de supercie
similares de la bacteria hospedadora (por ser
fagos especícos para P. aeruginosa), los aislados
F1, F5, F6 y F8 presentaron una mayor fuerza de
interacción. Posiblemente estos fagos reconocen un
mayor número de receptores para la misma célula
que el bacteriófago F2. Un comportamiento que se
ha reportado en la familia Siphoviridae, con ciclos
infectivos largos de ~80min [37].
Conclusiones
Las características exhibidas por los diversos
fagos encontrados en este estudio, incluyendo la
resistencia al tratamiento con solventes lipídicos,
los hace posibles miembros agrupables en el orden
Caudovirales, y probablemente en las familias
Myoviridae, Siphoviridae y Podoviridae. Los
aislados virales seleccionados son lítico-especícos
y capaces de generar placas de lisis de gran tamaño,
con características de estabilidad y perl infectivo
deseables para ser candidatos en el desarrollo
de potenciales agentes antagónicos con interés
biomédico, basados en enzibióticos para el control
de patógenos multirresistentes a los antibióticos
como P. aeruginosa.
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en junio de 2018, por el Fondo Editorial Serbiluz,
Universidad del Zulia. Maracaibo-Venezuela
Vol.26 Nº1, 2