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Depósito Legal: pp 199102ZU46 / ISSN 0798-2259
MARACAIBO, ESTADO ZULIA, VENEZUELA
Vol. XXIX (4) 2019
UNIVERSIDAD DEL ZULIA
REVISTA CIENTÍFICA
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
DIVISIÓN DE INVESTIGACIÓN
291
Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXIX, 4, 291 - 299, 2019
AVANCES EN LA CARACTERIZACIÓN DEL VENENO DE LA
MAPANARE Bothriopsis medusa: ALTERACIONES HEMOSTÁTICAS Y
RECONOCIMIENTO ANTIGÉNICO
POR UN ANTIVENENO VENEZOLANO
ADVANCES IN THE CHARACTERIZATION OF THE MAPANARE VENOM
Bothriopsis medusa: HEMOSTATIC ALTERATIONS
AND ANTIGENIC RECOGNITION BY A VENEZUELAN ANTIVENOM
Carmen Teresa Duque-Zerpa
1,2*
, Katherine Grillet
3
y María Eugenia Pineda
2
1
Servicio de Análisis Toxicológico (SATOX), Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela.
2
Unidad de Biotecnología,
Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela.
3
Escuela de Bioanálisis. Facultad de Medicina. Universidad Central de
Venezuela. *Teléfonos: +58 212 6052687. Correo e: ctduque@gmail.com
Recibido: 02/02/2019 Aceptado: 16/10/2019
RESUMEN
Bothriopsis medusa, conocida comúnmente como “viejita” o
“mapanare”, es una especie venenosa endémica de Venezuela,
localizada en los estados Aragua, Carabobo, Miranda, Vargas
y Distrito Capital. Esta importante localización geográca, su
coloración críptica, pequeño tamaño y hábitos semiarbóreos,
podrían darle cierta relevancia en la incidencia de accidentes
ofídicos. Como toda mapanare, se considera que podría inducir
un cuadro clínico que incluya: edema, necrosis, hemorragias
y/o coagulopatías; sin embargo, la información experimental
y clínica sobre esta especie es virtualmente nula. Este estudio
caracterizó parcialmente el veneno de B. medusa evaluando sus
perles electroforético y cromatográco (exclusión molecular),
sus actividades hemorrágica, brinogenolítica, coagulante y
anticoagulante, además de su reconocimiento antigénico por
un antiveneno venezolano empleando ensayos de inmuno-
precipitación. Los resultados obtenidos evidenciaron un perl
electroforético constituido por proteínas de ~19 a 130 kDa, aunque
claramente distribuidas en tres grupos (~19-27; 55-68 y 100-130
kDa). El fraccionamiento presentó cinco fracciones, sin embargo
solo las primeras tres presentaron niveles importantes de proteínas.
El veneno indujo actividad hemorrágica y brinógenolítica, pero no
anticoagulante o procoagulante in vitro. Los ensayos de inmuno-
precipitación mostraron bandas de reconocimiento veneno-
antiveneno. En conclusión, el veneno de B. medusa presentó
características toxinológicas que evidenciaron importantes
variaciones con respecto a las exhibidas por otros grupos de
mapanares en Venezuela, como aquellas pertenecientes al
género Bothrops las cuales se relacionaron esencialmente a la
ausencia de efecto procoagulante el cual determina actualmente
el diagnóstico y tratamiento en caso de envenenamiento ofídico
en el país. Adicionalmente, el veneno comparte antígenos o
en su defecto epítetos en común, con aquellos empleados en
la producción del antiveneno evaluado. Este estudio presentó
las primeras evidencias sobre el potencial toxinológico del
veneno de B. medusa, datos que pueden contribuir a ampliar
el conocimiento sobre los envenenamientos por “mapanares”
en el país y mejorar el manejo clínico en estos accidentes.
Palabras clave: Bothriopsis medusa; mapanare; alteraciones
hemostáticas; antiveneno
ABSTRACT
Bothriopsis medusa, commonly known as "viejita" or "mapanare"
is a venom species endemic to Venezuela. This is distributed in
the States of Aragua, Carabobo, Miranda, Vargas and Capital
District. This important geographic location, its cryptic coloration,
small size and semi-aerial habits, could give it some relevance
in the incidence of ophidian accidents. Like all mapanare, it is
considered that it could induce an accident characterized by
edema, necrosis, hemorrhages and/or coagulopathies, however
the experimental and clinical information on this species is scarce.
This study partially characterized the venom from B. medusa,
evaluating its eletrophoretic and chromatographic proles by
molecular exclusion, its hemorrhagic, brinogenolytic, coagulant
and anticoagulant activities. In addition to its antigenic recognition
by a Venezuelan antivenom, using immuno-precipitation
assays. The results obtained showed an electrophoretic prole
constituted by proteins of ~19 to 130 kDa, although clearly
distributed in three groups (~19-27, 55-68 and 100-130 kDa).
The fractionation presented ve fractions, however only the rst
three showed important levels of proteins. The venom induced
hemorrhagic and brinogenolytic activities, but not anticoagulant
or procoagulant in vitro. The immuno-precipitation assays showed
venom-antivenom recognition bands. In conclusion, the venom of
292
Evaluación preliminar del veneno de Bothriopsis medusa / Duque-Zerpa, C y col.
B. medusa presented toxinological characteristics that showed
important variations with respect to those exhibited by other
groups of mapanares in Venezuela, as those belonging to the
Bothrops genus, which were essentially related to the absence of a
procoagulant eect which determines the diagnosis and treatment
in case of ophidian envenomation in the Country. Additionally, the
venom shares antigens or, failing that, common epithets, with
those used in the production of the antivenom evaluated. This
study presented new evidences about the toxinological potential
of the venom of B. medusa, which can contribute to broaden the
knowledge about the envenomation from “mapanares” in the
Country and improve the clinical management of these accidents.
Key words: Bothriopsis medusa; mapanare; hemostatic
alterations; antivenom
INTRODUCCIÓN
En Venezuela, el envenenamiento por mordedura de serpiente
es considerado un problema de salud colectiva, debido al
elevado número de casos que se producen (expertos estiman
alrededor de 7.000 casos anualmente) y la gravedad de los
mismos [4, 28, 34]. Estos accidentes se considera están
relacionados especícamente a siete géneros [8, 22, 26, 27],
que incluyen: Micrurus (serpientes de coral), Lachesis (cuaimas),
Crotalus (cascabeles), además de Porthidium, Bothrops,
Bothriechis y Bothriopsis conocidas comúnmente en conjunto
como mapanares [8, 22, 28]. Sin embargo, en el caso particular
del género Bothriopsis se debe referir que existe una clara
divergencia taxonómica, algunos autores abogan por la sinonimia
de éste con Bothrops, mientras que otros han sostenido que
Bothriopsis debería permanecer como un género distinto [3, 5,
23, 35] y de hecho se puede observar actualmente el uso de
ambas denominaciones en la literatura cientíca en Suramérica
[5, 18, 22-24, 26, 30, 35, 36].
A grandes rasgos se considera que los envenenamientos
causados por las especies conocidas popularmente como
mapanares cursan con un cuadro clínico característico, que
puede incluir según la gravedad del caso: edema, dolor, necrosis,
hemorragias y/o alteraciones en la coagulación sanguínea,
eventos que son consecuencia del efecto aditivo y/o sinergista
del coctel enzimático presente en estos venenos [28, 29].
Sin embargo es ampliamente conocido que los venenos de
serpiente presentan una profunda variabilidad bioquímica en su
composición, la cual se ha evidenciado está asociada al género,
especie (inter e intra), localización geográca de los ejemplares
y sus características ontogénicas, factores que pueden inducir
variaciones relevantes en la expresión del cuadro clínico a
presentarse en las víctimas e incluso limitar la efectividad de
los antivenenos empleados clínicamente [6, 7, 10, 31, 34]. Esto
implica la necesidad de caracterizar los venenos de importancia
médica, haciendo énfasis en su composición bioquímica y
toxicidad, además de evaluar si los antivenenos, única terapia
especíca disponible para el tratamiento de estos casos, son
efectivos en la neutralización de las toxinas responsables por el
envenenamiento, lo cual permitiría garantizar la disponibilidad
de datos experimentales, que reejen la realidad del odismo en
las zonas estudiadas, facilitando la interpretación de los cuadros
clínicos, el seguimiento de los pacientes y la preparación de
antivenenos más efectivos. Sin embargo, en Venezuela para
el caso particular del género Bothriopsis no se dispone de
evaluaciones experimentales que expongan el potencial tóxico
de su veneno, lo cual puede implicar el abordaje de las víctimas
con protocolos empíricos.
En Venezuela se considera que el género Bothriopsis incluye
tres especies: taeniata, bilineata y medusa. B. taeniata descrita
en el estado Bolívar, B. bilineata en los estados Amazonas y
Bolívar, mientras que B. medusa (conocida popularmente como
“viejita” o “mapanare”) se considera distribuida exclusivamente
en el tramo central de la Cordillera de la Costa, localizándose
predominantemente en bosques nublados de los estados
Aragua, Carabobo, Miranda, Vargas y Distrito Capital, a una
altura entre los 1.000 a 2.000 metros sobre el nivel del mar
(m.s.n.m.), lo cual la hace una especie endémica [22, 23, 26].
Esta relevante localización geográca de B. medusa, la cual
abarca zonas densamente pobladas, aunado a su coloración
críptica, su pequeño tamaño que varia de 50 a 70 centimetros
(cm) y hábitos semiarbóreos [4, 23, 35] podrían implicar una
importante participación en la incidencia de accidentes ofídicos
en Venezuela. Con base en estas consideraciones, este estudio
caracterizó parcialmente el veneno de la serpiente B. medusa
y evaluó su reactividad frente a un antiveneno comercial
venezolano.
MATERIALES Y MÉTODOS
Veneno
Se utilizó una mezcla de veneno cristalizado, obtenido a partir
del ordeño manual de tres individuos adultos de B. medusa,
recolectados en la localidad de El Junquito, en el estado Vargas
y mantenidos en cautiverio en el serpentario de la Unidad de
Biotecnología. Facultad de Farmacia. Universidad Central
de Venezuela (UCV). Dicho veneno fue conservado hasta su
evaluación en un desecador (Duran
®
, Mod. Tam, Alemania) con
CaCl
2,
el cual fue mantenido al vacío y a 4°C en un cuarto frío
(Refrigeración Caiz
®
, Winter, Venezuela).
Antiveneno
Se utilizó el suero antiofídico polivalente (Lote 182), producido
en la Facultad de Farmacia de la UCV, el cual de acuerdo a
lo declarado por el fabricante, está constituido por fragmentos
F(ab’)
2
de inmunoglobulinas, obtenidas por la inmunización de
caballos (Equus caballus) con una mezcla de venenos de los
géneros Bothrops y Crotalus y neutraliza al menos 2 miligramos
(mg) de veneno de B. colombiensis por cada mililitro (mL) de
antiveneno.
293
Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXIX, 4, 291 - 299, 2019
Fraccionamiento del veneno
El fraccionamiento del veneno se realizó por cromatografía de
exclusión molecular. Para esto 5,1 miligramos (mg) de veneno
disuelto en 2,5 mililitros (mL) de una solución de acetato de
amonio 0,02 Molar (M) y previamente centrifugados a 1.240 G
durante 10 minutos (min) (Centrífuga Sorval
®
, GLC-1, China), se
eluyeron en una columna Bio-Silect
®
SEC 125-5 de 7,8 x 300
milímetros (mm), previamente equilibrada con una solución de
acetato de amonio 0,02 M y ajustada a una velocidad de ujo
de 0,7 mL/min. Los eluatos obtenidos se evaluaron a través de
un detector ultravioleta (UV) (Bio-Rad
®
, BioFrac
TM
, EUA) a 280
nanómetros (nm) y se registró el cromatograma correspondiente.
Electroforesis
La electroforesis del veneno se realizó en geles de poliacrilamida
al 12,5%, en condiciones disociantes con sodio dodecilsulfato
(SDS), en presencia y ausencia de una mezcla comercial de
inhibidores de proteasas (SIGMA
®
Cat P-2714). Previamente
las muestras, con o sin inhibidores, se disolvieron en buer de
muestra (BM) constituido por 3% SDS, 30% glicerol y azul de
bromofenol en buer Tris-HCl 1,5 M; pH 6,8. La electroforesis
se llevo a cabo a 120 voltios (V) hasta completar la corrida. Las
bandas de proteínas fueron visualizadas con azul de Coomasie
R-250 y su masa molecular se estimó empleando como referencia
un marcador de peso molecular de amplio rango (BIO-RAD
®
Cat.
161-0318) [19].
Determinación de la actividad coagulante
La actividad coagulante fue evaluada empleando plasma
humano citratado (9:1) como sustrato, el cual se distribuyó a
razón de 0,2 mL en tubos de ensayo de plástico, los cuales se
incubaron en baño María (Gallenkamp
®
, Model 2, Inglaterra) a
37°C durante 3 min. Post incubación se adicionó, a razón de 4
tubos por tratamiento, alícuotas de 0,1mL de soluciones con 100
y 200 microgramos (μg) de veneno en solución de NaCl 0,85% y
se midió el tiempo de coagulación del plasma con la ayuda de un
cronómetro (Casio®, HS-5, Japón). Los resultados se expresaron
como dosis coagulante mínima (DCM), denida como la menor
cantidad de veneno que indujo la coagulación del plasma en 1
min. Los controles fueron constituidos por soluciones de trombina
5 unidades (U)/mL (SIGMA
®
) y de NaCl 0,85% [15].
Determinacion de la actividad anticoagulante
Alícuotas de plasma humano citratado (9:1) se distribuyeron a
razón de 0,1 mL en tubos de ensayo de vidrio y se incubaron en
baño María (Gallenkamp®, Model 2, Inglaterra) a 37°C durante
5 min. Post incubación se añadió, a razón de cuatro tubos por
tratamiento, 0,05 mL de soluciones de veneno conteniendo
25; 50; 100 y 200 μg en solución de NaCl 0,85% o 0,05 mL del
vehículo. Las mezclas se continuaron incubando a 37°C durante
5 min, en baño María (Gallenkamp®, Model 2, Inglaterra), al cabo
de los cuales se adicionó 0,1 mL de CaCl
2
0,1 M y se completó
la incubación durante 30 min, registrándose la formación o no de
un coagulo estable [25].
Determinación de la actividad proteolítica del veneno sobre
brinógeno
Mezclas constituidas por una concentración constante de
brinógeno humano (100 µg, SIGMA
®
) y concentraciones
seriadas del veneno (2,28x10
-4
a 0,5 µg), en buer Tris-HCL
pH 7,5 y 0,02 M, se incubaron en baño María (Gallenkamp
®
,
Model 2, Inglaterra) a 37º C durante 30 min. Post incubación,
se adicionó a cada una de las muestras 100 µL de una solución
3,2 % ß-mercapto-etanol en BM y se llevaron a un baño de
agua hirviendo durante 5 min. La degradación diferencial de
las cadenas α, β y/o γ del brinógeno fue expuesta empleando
electroforesis con geles de poliacrilamida-SDS al 12,5% con
tinción de azul de Coomassie R-250 [9].
Evaluación de la actividad hemorrágica
Alícuotas de 0,1 mL de soluciones de veneno conteniendo
2,5 y 5,0 µg en solución de NaCl 0,85% se inyectaron por la vía
intradérmica en la región abdominal a grupos de cuatro ratones
(Mus musculus) (cepa IVIC) por dosis. Un grupo adicional de
ratones, se trató con 0,1 mL del vehículo y constituyó el control del
experimento. Dos horas (h) después de la inyección, los ratones
se sacricaron por dislocación cervical, se removió la piel de la
región abdominal, y se midió el área de la lesión hemorrágica.
Posteriormente, se determinó el diámetro (mm) de las lesiones
por la aplicación de la formula: D= 2√área/π. Los resultados se
expresaron en términos de diámetro promedio para cada grupo
de tratamiento [18].
Evaluación del reconocimiento antigénico del veneno por
un antiveneno comercial venezolano
En placas de Petri de plástico de 6 cm de diámetro, se
adicionaron 5 mL de una solución al 1% agarosa en buer de
fosfato salino (PBS) pH 7,2. Una vez solidicado el gel, con
la ayuda de un sacabocado se abrieron pozos de 4-5 mm de
diámetro formando un patrón hexagonal con un pozo central. En
el centro de las placas se colocaron 20 µL del antiveneno y en
su periferia 20 µL de soluciones del veneno conteniendo de 5 a
80 µg en PBS pH 7,2. Posteriormente las placas se incubaron en
cámara húmeda a temperatura ambiente durante 24 h, al cabo
de las cuales fueron lavadas con cambios consecutivos de PBS
diluido (1:4), empleando agitación leve durante 24 h (Gyrotory
®
,
Shaker-Model 62, EUA). Las líneas de precipitación por formación
de inmunocomplejos fueron evidenciadas por tinción con azul de
Coomassie R 250 [21].
Análisis estadístico
Para la determinación de la DCM se construyeron grácas dosis–
respuesta, con curvas de regresión lineal con transformaciones
294
Evaluación preliminar del veneno de Bothriopsis medusa / Duque-Zerpa, C y col.
semilogarítmicas, a partir de las cuales se calculó la ecuación
de la recta y los valores de “r
2
”, considerándose regresiones
signicativas a un intervalo de conanza del 95% (P<0,05). Los
resultados se estimaron a partir de la ecuación de la recta y se
expresaron como la media aritmética ± la desviación estándar
de tres evaluaciones independientes, empleando estadística
descriptiva. Se utilizó el programa estadístico GraphPad Prism
®
5.01.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
B. medusa es una especie venenosa endémica de Venezuela,
la cual abarca importantes zonas regiones pobladas en la región
central de la Cordillera de la Costa [23, 26]. Ante la ausencia de
datos experimentales o clínicos especícos para esta especie,
se considera con base en estudios para otras mapanares
en Venezuela o en otras especies del género Bothriopsis en
Suramérica como taeniata, punctata o bilineata que B. medusa
podría ser poseedora de un veneno con características
hemotóxicas y miotóxicas [18, 24, 30, 36]. Sin embargo, la
reconocida variabilidad en la constitución bioquímica de los
venenos y sus repercusiones [6, 7, 10, 31, 34], implican la
necesidad de caracterizar su veneno y de evaluar si sus toxinas
son reconocidas por los antivenenos empleados en el país, de
manera de disponer de datos experimentales que sienten bases
para garantizar el óptimo abordaje clínico en accidentes por ésta
especie.
El fraccionamiento del veneno de B. medusa, empleando
cromatografía de exclusión molecular (Bio-Silect
®
SEC 125-
5), originó un perl de elución constituido por un total de cinco
picos bien denidos, los cuales se identicaron de FI a FV, como
se observa en la FIG. 1. La FI constituyó el pico principal del
cromatograma y es seguida en orden de magnitud por FII y FIII,
respectivamente. FIV y FV son las fracciones minoritarias, con
una magnitud de absorbancia aproximadamente 8-10 veces
menor a lo obtenido para FI, FII o FIII (FIG. 1). Dicho perl,
considerando el rango de exclusión de la columna empleada (5-
100 kDa), permite referir que el veneno evaluado podría estar
constituido principalmente por proteínas de mediana y alta masa
molecular. Entre las cuales se pudieran encontrar proteínas con
actividad tipo fosfodiesterasas (94–140 kDa), L amino-ácido
oxidasas (85-150 kDa), hialuronidasas (73 kDa), así como ciertas
metalo y serinoproteasas [16, 20].
FIGURA 1. PERFIL DE ELUCIÓN OBTENIDO POR
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR DEL
VENENO DE Bothriopsis medusa
Columna: Bio-Silect
®
SEC 125-5 (7,8 x 300 mm). Elusión:
Acetato de amonio 0,2 M. FI: fracción I. FII: fracción II. FIII:
fracción III. FIV: fracción IV. FV: fracción V
Los resultados representan la observación de siete
evaluaciones independientes (n: 7)
Esta constitución proteica sugerida al observar el cromatograma
en la FIG. 1 es respaldada por el perl electroforético, obtenido
para el veneno de B. medusa, el cual se presentó en la FIG.
2. Dicho perl mostró una distribución de bandas proteicas
aproximadamente en el rango de 19 a 130 kDa, las cuales se
distribuyen claramente en tres grupos que comprenden proteínas
aproximadamente de 19-27; 55-68 y 100-130 kDa, sugiriendo
la presencia en el veneno de los constituyentes enzimáticos
referidos previamente, además de enzimas tipo fosfolipasas A
2
(~18 kDa) y las diferentes clases de metaloproteasas o toxinas
hemorrágicas: PI (20-30 kDa), PII (30-60 kDa) y PIII (60-100 kDa)
[16, 20], grupos enzimáticos que han sido descritos en estudios
previos para venenos del género Bothriopsis en Suramérica [30,
36].
FIGURA 2: PERFIL ELECTROFORÉTICO (GEL DE
POLIACRILAMIDA-SDS 12,5%) DEL VENENO DE LA
SERPIENTE Bothriopsis medusa EN PRESENCIA Y
AUSENCIA DE UNA MEZCLA DE INHIBIDORES DE
PROTEASAS (SIGMA
®
Cat P-2714)
Carriles: 1. Marcador de peso molecular (BIO-RAD
®
Cat. 161-
0318). 2. Veneno con inhibidor. 3. Veneno sin inhibidor
1 2 3
295
Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXIX, 4, 291 - 299, 2019
Adicionalmente al comparar entre si los perles del veneno con
y sin inhibidores de proteasas, no se evidenciaron diferencias
relevantes bajo las referidas condiciones. Solo se apreció la
desaparición de una banda de ~109 kDa, en el caso del perl sin
inhibidores, banda posiblemente asociada a la degradación de
ciertas metaloproteasas (FIG. 2). Esto sugiere, en las condiciones
experimentales empleadas, bajos niveles de proteasas con
actividad autocatalítica en el veneno evaluado, actividad que
se ha evidenciado de forma marcada en estudios previos con
venenos del género Bothrops como B. colombiensis [7].
En el caso de la actividad coagulante los resultados obtenidos
se presentaron en la TABLA 1. En ésta se muestra que, bajo
las condiciones de este estudio, las elevadas concentraciones
de veneno evaluadas (100 y 200 µg/0,1mL), no promovieron la
coagulación del plasma humano. En el caso de los controles, la
solución de trombina de 5 unidades/mL indujo la coagulación del
plasma a los 29,20±1,60 segundos (seg) (n: 3), mientras que con
la solución de NaCl 0,85% el plasma se mantuvo incoagulable.
TABLA I
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD COAGULANTE DEL
VENENO DE Bothriopsis medusa
Concentración evaluada
(µg/100µL)
Efecto sobre el plasma
100 No coaguló
200 No coaguló
Control negativo (NaCl 0,85%) No coaguló
Los resultados representan la observación de tres evaluaciones
independientes (n: 3)
Estos resultados sugieren que el veneno de B. medusa
podría carecer de enzimas tipo activadores del factor X y/o
protrombina, grupos relacionados con la acción procoagulante
directa de los venenos sobre el plasma humano [32], aunque
no se debería descarta que éstas pudieran encontrarse en muy
bajas concentraciones en el veneno evaluado. Estos resultados
coinciden con reportes previos para serpientes de este género,
como B. taeniata (Ecuador), aunque también se debe referir que
en el caso de otras especies de dicho género como B. punctata
(Ecuador), se ha reportado una leve actividad coagulante
(DCM: 21±3 μg) [18] y diere marcadamente de lo reportado
para venenos del género Bothrops en Venezuela, los cuales se
caracterizan por su elevada actividad procoagulante [6, 33], la
cual incluso ha llegado a determinar el diagnóstico y tratamiento
en casos de envenenamiento ofídico en Venezuela [27].
En la evaluación de la actividad anticoagulante se observó que
el veneno evaluado no inhibió la coagulación del plasma humano
bajo las condiciones de este estudio (TABLA II). Por el contrario,
concentraciones del veneno de 100 y 200 µg/50 µL indujeron la
formación de un coágulo rme en ausencia de CaCl
2
a los 5 min
de incubación; mientras que con concentraciones de 25 y 50
µg/50 µL se evidenció la formación de un coágulo estable a los
30 min, después de la adición de calcio al medio (n: 3)
.
TABLA II
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTICOAGULANTE DEL
VENENO DE Bothriopsis medusa
Concentración evaluada
(µg/50µL)
Efecto sobre el plasma
25 Coaguló
50 Coaguló
100 Coaguló en ausencia de CaCl
2
200 Coaguló en ausencia de CaCl
2
Control negativo (NaCl
0,85%)
No coaguló
Control positivo (NaCl
0,85%/ CaCl
2
)
Coaguló
Los resultado Los resultados representan la observación de tres
evaluaciones independientes (n: 3)
Estos resultados permiten señalar dos aspectos interesantes:
(1) En efecto, el veneno de B. medusa evaluado presenta
constituyentes capaces de inducir la coagulación del plasma
humano, sin embargo éstos se encuentran en muy bajas
concentraciones en comparación a lo reportado para diferentes
venenos del género Bothrops en Venezuela [6], otras especies
del género Botriopsis como punctata de Ecuador (DCM: 21±3
μg) [18] o incluso algunas especies crotálicas, las cuales se
caracterizan por su débil actividad procoagulante in vitro como C.
durissus cumanensis (estado Zulia-Venezuela) (DCM: 31,4±2,3
µg) [31]. (2) Este veneno podría carecer de proteínas capaces
de prolongar el tiempo de recalcicación del plasma o éstas se
encuentran en muy bajas concentraciones, por lo que su efecto
no pudo ser evidenciado bajo las condiciones de este estudio. De
hecho Verheij y col. [38] evaluando el potencial anticoagulante
de cierto grupo enzimático señalaron con base en la magnitud
de este efecto que las enzimas evaluadas podían dividirse en
tres grupos que incluyen: (1) las fuertemente anticoagulante,
(2) las que requieren altas concentraciones para mediar dicho
efecto (3-10µg/mL) y aquellas (3) débilmente anticoagulantes,
las cuales incluso a muy elevadas concentraciones (20µg/mL)
no prolongaron el tiempo de coagulación signicativamente (< a
25 min).
Con esto en consideración y al revisar los estudios previos para
venenos en los que se ha reportado efecto anticoagulante, se
puede observar que algunos de ellos podrían entrar dentro de esa
consideración de débilmente anticoagulante como es el caso de
296
Evaluación preliminar del veneno de Bothriopsis medusa / Duque-Zerpa, C y col.
Porthidium lansbergii rozei (estado Sucre-Venezuela) o Micrurus
mipartitus (Colombia), para los cuales se reportó un tiempo de
recalcicación del plasma de 5 y 10 min, respectivamente [11,
25].
Entre los constituyentes de los venenos responsables
por este efecto se han descrito fosfolipasas A
2
(fuertemente
básicas)
,
metaloproteasas (α-brinogenasas), serinoproteasas
(activadores de proteína C, enzimas tipo trombina), L amino-
ácido oxidasas y/o proteínas liberadoras de lectina tipo C, estas
últimas carentes de actividad enzimática [17, 36], las cuales han
sido descritas en venenos de la familia Viperidae que incluyen
Bothrops jararaca, B. atrox, B. cotiara, B. moojeni, B. jararacussu,
B. neuwiedi, B. leucurus y Lachesis muta [13, 14, 17].
En el caso de la actividad brinogenolítica, los resultados
obtenidos evidenciaron la degradación proteolítica directa del
brinógeno, por el veneno de B. medusa, bajo las condiciones de
este estudio (FIG. 3), la cual se caracterizó por la degradación de
las cadenas α y β del referido sustrato. En el caso de la cadena
α, la degradación se inició con 0,019 µg de veneno y se observó
totalmente degradada con el tratamiento con 0,50 µg. En el caso
de la cadena β la degradación se inició con 0,167 µg, pero ésta
solo fue parcial, incluso al ser expuesta a 0,50 µg de veneno.
Mientras que la cadena γ se mantuvo inalterada, como se aprecia
en la FIG. 3.
FIGURA 3. ACTIVIDAD FIBRINOGENOLÍTICA DEL VENENO
DE Bothriopsis medusa. Carriles: 1. Peso Molecular (BIO-
RAD
®
Cat. 161-0318). 2. Fibrinógeno (100 µg). 3-10: Fibrinógeno
(100 µg). Vs veneno (0,0002; 0,0007; 0,002; 0,006; 0,019; 0,056;
0,167 y 0,50 µg)
Los resultados representan la observación de tres
evaluaciones independientes (n: 3)
Esta actividad ha sido descrita en diferentes venenos de
la familia Viperidae en Venezuela como Bothrops, Crotalus o
Porthidium [10, 11, 28]. Al comparar los resultados obtenidos, con
reportes previos para venenos del género Bothrops en Venezuela,
se pueden referir diferencias marcadas en los patrones de
degradación. Por ejemplo, para el veneno de B. isabelae [29] los
autores reportaron la degradación total y selectiva de la cadena
α, tras la incubación del sustrato con 1µg del veneno durante
30 min, mientras que la degradación de la cadena β se inició a
la 2 h. Resultados similares fueron reportados para venenos de
B. venezuelensis de diferentes localidades de la Región Capital
(Lagunetica, Baruta, La Boyera) [10], aunque en todos los casos
el sustrato se enfrentó a 0,1 µg de veneno. Sin embargo, en
comparación con reportes previos para el veneno de Porthidium
lansbergii rozei (estado Sucre-Venezuela) se pueden referir
similitudes en el patrón de degradación (total de la cadena α y
parcial de la β) tras la incubación de 100 µg brinógeno:1 µg
veneno durante 30 min [11].
Estos resultados sugieren la presencia de una relevante
actividad brinogenolítica en el veneno de B. medusa, la cual
presentó una elevada potencia sobre la cadena β (como en el
caso de P. l. rozei) y una magnitud α brinogenolítica dentro de
lo descrito para los venenos de B. isabelae, B. venezuelensis y
P. l. rozei [10, 11].
Estudios previos tras la puricación y caracterización de las
enzimas responsables de este efecto en diferentes venenos de
serpiente, incluyendo especímenes del género Bothriopsis como
B. taeniata [37], han clasicado la mayoría de ellas en α, β o
γ brinógenasas, según la cadena del brinógeno/brina sobre
la cual actúen más rápidamente y se han identicado como:
(1) Serinoproteasas, las cuales incluyen las llamadas enzimas
tipo trombina (degradan las cadenas α y/o β) y las brino(ge)
líticas, para las que se ha descrito usualmente actividad del
tipo β-brinogenasa [2, 20, 31]. Además de (2) Metaloproteasas
dependientes de zinc, capaces de hidrolizar rápidamente la
cadena α del brinógeno [1, 7, 12, 32, 37].
En el caso de la evaluación de la actividad hemorrágica, se
observó que el veneno de B. medusa indujo lesiones en el modelo
de piel de ratón, las cuales se caracterizaron como lesiones bien
denidas, con un diámetro promedio de 10,75±0,4 y 12,77±1,05
mm (n: 4, individuos) con dosis de 2,5 y 5 µg, respectivamente.
Estos resultados coinciden con reportes previos en venenos
de otras especies de este género, como B. punctata o taeniata
(Ecuador) para los cuales se reportó, después de la inyección
de 10 µg de veneno, el desarrollo de lesiones hemorrágicas
en ratones con diámetros promedio de 15,60 y 29,60 mm,
respectivamente [18]. Adicionalmente, se debe referir que la
actividad hemorrágica evidenciada en el veneno de B. medusa,
sugiere que éste podría tener un elevado potencial hemorrágico,
comparable al atribuido a especies del género Bothrops en
Venezuela [6, 7, 12, 29].
En cuanto al reconocimiento del veneno de B. medusa por el
antiveneno venezolano los resultados obtenidos, en el ensayo de
inmunodifusión en geles de agarosa, se presentaron en la FIG.
4. En ésta se observó la presencia de bandas de precipitación
o inmuno-complejos, para las diferentes concentraciones del
veneno evaluado, las cuales fueron observadas como una línea
297
Revista Cientíca, FVC-LUZ / Vol. XXIX, 4, 291 - 299, 2019
continua de inmuno-precipitación mostrando identidad completa
[21]. Esto permite sugerir, la presencia de antígenos o de epítetos
en común entre el veneno de B. medusa y los empleados en el
inoculo de producción del antiveneno venezolano. Sin embargo,
se debe considerar que este reconocimiento antigénico no
garantiza la efectiva neutralización de los efectos tóxicos
inducidos por el veneno evaluado, por lo que deben realizarse
pruebas especícas de neutralización de actividad [15].
FIGURA 4. RECONOCIMIENTO ANTIGÉNICO DEL VENENO DE
LA SERPIENTE Bothriopsis medusa POR UN ANTIVENENO
VENEZOLANO. Se enfrentaron concentraciones seriadas del
veneno (5-80 µg/PBS pH 7,2) con 20 µL antiveneno venezolano
(SAOP). Control: PBS pH 7,2
Gel teñido con azul de coomassie R-250. La evaluación fue
realizada por duplicado.
Los resultados obtenidos sugieren que el veneno de B. medusa,
especie endémica de Venezuela, puede inducir un importante
efecto hemorrágico y carece de actividades procogulante y
anticogulante in vitro, aunque exhibió un importante efecto
proteolítico sobre el brinógeno. Estas últimas sugieren que en
las víctimas de accidentes por esta especie se podría esperar un
cuadro clínico caracterizado por la ausencia de coagulopatias,
sin embargo no se debería descartar que estas se presenten
tardíamente a consecuencia del consumo del brinógeno.
Adicionalmente, aunque no se encuentran referencias de
envenenamiento por B. medusa en la literatura (Scielo, PubMed,
ResearchGate), probablemente porque comparte distribución
geográca con importantes especies del género Bothrops, como
B. colombiensis y B. venezuelensis [23, 26], y usualmente no
se dispone del ejemplar involucrado en el accidente para su
identicación [31], las observaciones de este estudio coinciden
con hallazgos clínicos referidos en reportes previos de
envenenamiento humano con especies del género Bothriopsis
en Brasil, como taeniata [36], veneno que se caracterizó por la
ausencia de actividad procoagulante in vitro y una importante
actividad hemorrágica in vivo [18].
CONCLUSIONES
El veneno de la mapanare B. medusa (El Junquito. estado
Vargas) se caracterizó por presentar una importante actividad
hemorrágica y proteolítica sobre el brinógeno humano, además
de la carencia de efectos anticoagulante y procoagulante in vitro.
Estos resultados constituyen las primeras evidencias del potencial
toxinológico del veneno de B. medusa, datos que pueden
contribuir a ampliar el conocimiento sobre los envenenamientos
por “mapanares” en el país y mejorar el manejo clínico de los
accidentes por ésta especie endémica venezolana.
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