https://doi.org/10.52973/rcfcv-e34337
Recibido: 12/10/2023 Aceptado: 11/01/2024 Publicado: 11/04/2024
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Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XXXIV, rcfcv-e34337
RESUMEN
La babesiosis, es una enfermedad causada por un protozoo
intraeritrocitario del Phylum Apicomplexa, clase Sporozoea, subclase
Piroplasmea, superfamilia Babesioidea, familia Babesidae, género
Babesia dentro de las cuales destacan las especies Babesia bovis y
B. bigemina en bovinos. Se presenta en los trópicos y sub trópicos
del mundo y es trasmitida por garrapatas Rhipicephalus microplus,
principalmente. Las muestras de sangre completa se analizaron
mediante frotis sanguíneos coloreados con Giemsa, PCR convencional
para detectar, a partir del ADN en regiones variables del gen 18S
rARN, la banda de 393 pb correspondiente a B. bigemina, sometida
luego a la enzima de restricción Alu I (secuencia de reconocimiento
5’AG↓CT3’), capaz de cortar el amplicon ADN ribosomal de B. bigemina
generando tres fragmentos de 38, 144 y 211 pb. Para la amplicación
qPCR–RT, se utilizó el kit qPCR Primer Design especíco para B.
bigemina. Por punción en la vena yugular se obtuvieron 100 muestras
de bovinos pertenecientes a las Unidades de Producción Agropecuaria
(UPA) de dos niveles geomorfológicos menor a 2.200 msnm (bajo)
y mayor a 2.200 msnm (alto), municipio Girón, callejón interandino
de la República del Ecuador con ganado bovino Mestizo Holstein y
Criollo, productores de leche. Se detectó la garrapata R. microplus en
el 100 % de los animales evaluados. Con encuestas epidemiológicas
se analizaron diferentes factores de riesgo locales asociados con la
babesiosis bovina, según resultados obtenidos con cada una de las
técnicas. Utilizando frotis sanguíneos se identicaron 16 muestras
positivas a B. bigemina, 7,54 % en bajo y 25,53 % en alto. Por PCR–RFLP
resultaron 11 positivas con 9,43 en bajo y 12,76 % en alto. La qPCR–RT
mostró una prevalencia superior, del 43 % de B. bigemina con un
54,72 bajo y 29,79 % alto. La altitud se asoció signicativamente con
parasitemias en zonas altas según la técnica de Frotis coloreado
con Giemsa. Diferentes resultados se obtuvieron con el kit qPCR,
revelando parasitemias superiores en las zonas bajas, con carga
baja de vectores, baños garrapaticidas con menos de 60 días y en
la época de invierno, cuando se incrementó signicativamente la
presencia de B. bigemina.
Palabras clave: Epidemiología; niveles geomorfológicos; qPCR–RT;
PCR–RFLP; babesiosis; factores de riesgo
ABSTRACT
Babesiosis is a disease caused by an intraerythrocytic protozoan
Phylum Apicomplexa, class Sporozoea, subclass Piroplasmea,
superfamily Babesioidea, family Babesidae, genus Babesia within
which the species Babesia bovis and B. bigemina in cattle stand out.
It occurs in the tropics and subtropics of the World and is transmitted
mainly by Rhipicephalus microplus ticks. Whole blood samples were
analyzed using Giemsa stained blood smears, conventional PCR to
detect, from the DNA in variable regions of the 18S rRNA gene, the
393 bp band corresponding to B. bigemina, then subjected to the
restriction enzyme Alu. I (5'AG↓CT3' recognition sequence), capable
of cutting the ribosomal DNA amplicon of B. bigemina, generating
three fragments of 38, 144 and 211 bp. For qPCR–RT amplication,
the B. bigemina–specic Primer design qPCR kit was used. By jugular
vein puncture, 100 samples of bovines belonging to the Agricultural
Production Units (UPA) of two geomorphological levels less-than
2,200 masl (low) and greater-than 2,200 masl (high) were obtained,
Girón Municipality, inter–Andean alley of the Republic from Ecuador
with Holstein and Criollo Mestizo cattle that produce milk. The
R.microplus tick was detected in 100% of the animals evaluated. With
epidemiological surveys, different local risk factors associated with
bovine babesiosis were analyzed, according to the results obtained
with each of the techniques. Using blood smears, 16 of samples
positive for B. bigemina were identied, 7.54% in low and 25.53% in
high. By PCR–RFLP 11 with 9.43% low and 12.76% high. The qPCR–RT
showed a higher prevalence of 43% of B. bigemina with 54.72% low and
29.79% high. Altitude was signicantly associated with parasitemia
in high areas according to the Giemsa–stained smear technique.
Different results were obtained with the qPCR kit, which revealed
higher parasitemia in low–lying areas, with low vector load, tick–killing
baths less-than 60 days, and in the winter season, when the presence
of B. bigemina increased signicantly.
Key words: Epidemiology; geomorphological levels; qPCR–RT;
PCR–RFLP; babesiosis; prevalence; risk factors
Análisis epidemiológico y molecular de la Babesiosis por Babesia bigemina
en bovinos del municipio Girón, Azuay, Ecuador
Molecular and epidemiological analysis of Babesiosis by Babesia bigemina in cattle from the Giron
Municipality, Azuay, Ecuador
Jorge Gualberto Bustamante–Ordóñez
1,3
* , Diego Andrés Bustamante–Guzmán
2
, Sergio Emiro Rivera–Pirela
3
1
Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Agropecuarias. Cuenca, Ecuador.
2
Universidad de Cuenca, Facultad de Ciencias Químicas. Cuenca, Ecuador.
3
Universidad del Zulia, Facultad de Ciencias Veterinarias. Zulia, Venezuela.
*Autor para correspondencia: jorge.bustamante@ucuenca.edu.ec
Análisis epidemiológico y molecular de la babesiosis en bovinos / Bustamante-Ordóñez y cols.____________________________________
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INTRODUCCIÓN
La babesiosis, es una enfermedad causada por un protozoo
intraeritrocitario del Phylum Apicomplexa, clase Sporozoea, subclase
Piroplasmea, superfamilia Babesioidea, familia Babesidae, género
Babesia dentro de las cuales destacan las especies Babesia bovis y
B. bigemina en bovinos (Bos), como principales responsables de la
enfermedad. Se presenta en los trópicos y sub trópicos del mundo y
es trasmitida principalmente por garrapatas Rhipicephalus microplus
[1]. Sin embargo, algunos investigadores han identicado Babesia
spp. en altitudes sobre 1.200 msnm. Para garrapatas Ixodes spp., se
tienen registros de su presencia hasta 2.410 msnm. en Venezuela
[2]. El cambio climático pudiera ser un elemento determinante en
la distribución de las garrapatas. Otros factores, como el cambio
de uso del suelo, así como la movilidad del ganado, pueden jugar un
papel importante en la introducción de garrapatas a nuevas áreas
y, por lo tanto, facilitar la introducción de la babesiosis bovina entre
otras enfermedades [3, 4].
La provincia del Azuay, tiene 3 pisos altitudinales: 1) zona sierra,
2) zona de estribación y 3) zona costanera. En cada geomorfología,
los tipos y objetivos de explotación bovina no son iguales debido
a la presencia de climas y microclimas en cada uno de los niveles,
con zonas de estabilidad enzoótica para babesiosis bovina [5]. En
el municipio Girón, existen niveles que se consideran marginales o
inhóspitos para la supervivencia de la garrapata, agente transmisor
de la babesiosis [6]. Sin embargo, un estudio piloto realizado en
esta zona, mostró casos de babesiosis producida por B. bigemina y
la presencia del vector a 2.790 msnm.
La Babesiosis es una enfermedad que presenta considerables
implicaciones patológicas en los animales domésticos y silvestres,
donde quiera que existan las garrapatas, pero especialmente en los
trópicos donde pueden llegar a causar grandes pérdidas económicas.
B. bigemina y B. bovis son parásitos intraeritrocitarios obligados
[7]. La trasmisión es exclusivamente por garrapatas. B. bovis es
transmitida únicamente por las larvas de Rhipicephalus (Boophilus)
microplus, mientras que, B. bigemina es transmitido por las ninfas y
los adultos y, posiblemente por machos. Por este motivo, el período
de incubación de la babesiosis por B. bovis es más corto que en el
caso de B. bigemina [7]. En América Latina, las pérdidas económicas
registradas en zonas tropicales y sub tropicales están asociadas,
principalmente a la infección del ganado bovino por B. bovis y B.
bigemina [8]. En Brasil, los gastos por el control de las garrapatas
y las enfermedades que transmiten, llegan a más de 2 billones USD
anuales. En Colombia superan los 76.713 millones de pesos por año [9].
Los factores del hospedador asociados con la enfermedad incluyen la
edad, la raza y el estado inmunitario [10]. Las razas de ganado Bos indicus
suelen ser más resistentes a la babesiosis que las Bos taurus. Este es un
resultado de la relación evolutiva entre el ganado B. indicus, la garrapata
del género B. microplus y la babesia [11]. Así mismo, se ha reportado
una relación, entre la época del año o la estación y la prevalencia de
la babesiosis clínica, citándose una mayor incidencia ocurre poco
después del pico de la población de garrapatas que suele ocurrir en
la época de verano o más cálida [9]. De los factores climáticos, aire y
temperatura son los más importantes por su efecto sobre la actividad de
las garrapatas. Las temperaturas más altas aumentan su aparición. Las
mayores pérdidas ocurren en áreas marginales donde la población de
garrapatas es muy variable dependiendo de las condiciones ambientales
[11]. La infección por babesia en el ganado mayormente alcanza su punto
máximo en verano [12].
Se han descrito diferentes técnicas diagnósticas para babesiosis
bovina. Generalmente, la primera opción es el frotis de sangre con
tinción de Giemsa para demostrar microscópicamente la presencia y
morfología del parásito [13]. Otra lo constituye los ensayos de reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección diagnóstica de
Babesia spp. La cual posee el potencial de proporcionar rápidamente
resultados cualitativos con alta sensibilidad. La PCR–RFLP, con
ayuda de cortes del ADN con enzimas de restricción (endonucleasas),
permite diferenciar bandas características que permiten diferencias
claramente la B. bovis de la B. bigemina [1, 14]. Estos ensayos de PCR,
tienen varias ventajas sobre las pruebas diagnósticas microscópicas
y serológicas, dado que, se ha demostrado que la sensibilidad de
estos ensayos para detectar babesiosis bovina es mayor que la de
los métodos de detección microscópicos [15].
Otra técnica más novedosa la constituye la qPCR–RT o PCR en
tiempo real cuantitativa, está es capaz de detectar parasitemias,
cuando estas son extremadamente bajas, como ocurre en animales
portadores y aislamientos diferenciadores [16, 17].
Los principales marcadores moleculares utilizados en la
identificación de B. bovis y B. bigemina son: el gen BNMK, Bv80
Citocromo, BvVA1, gen citocromo b, Factor de elongación 1α, msa–1,
msa–2, RAP–1, CT–SPR, rARN y SBP 1–2–3. Su utilización en la detección
de las babesias bovinas varía dependiendo de la región geográca de
estudio, el grado de conservación del gen y los resultados de estudios
previos que concluyen su utilidad diagnóstica [18]. El gen ribosomal
18S rARN, denominado subunidad pequeña o SSU (del inglés “small
ribosomal subunit”), es ampliamente utilizado para realizar estudios
moleculares y logenéticos entre miembros del phylum Apicomplexa,
debido a que poseen regiones muy conservadas [19, 20, 21]. Tiene un
alto nivel de sensibilidad, y reportes de identidad cercanos al 100 %
[22, 23, 24, 25, 26]. Debido a la mayor sensibilidad, la qPCR–RT puede
detectar parasitemias bajas o intermitentes que pueden escapar
a la detección por otros métodos [27]. Actualmenteen el mercado
se encuentra a disposición un kit comercial qPCR TaqMan® para la
detección y cuanticación de B. bigemina diseñado en base a los
genes 18S rRNA de cepas americanas y asiáticas [15].
Con esta investigación esperamos obtener la prevalencia
de la babesiosis por B. bigemina en bovinos de varios estratos
geomorfológicos en el municipio Girón–Ecuador, utilizando tres
métodos de diagnóstico (FROTIS, PCR– RFLP y qPCR–RT), determinar
los factores de riesgo locales asociados con la presencia de B.
bigemina y elaborar un mapa georreferenciado del Municipio con la
distribución del parásito en los diversos pisos de altitud.
MATERIALES Y MÉTODOS
Tamaño de la muestra y Características del rebaño a evaluar:
La población bovina del Cantón Girón, Ecuador, en la zona alta (más
de 2.200 msnm) resulto ser de 4.900 animales, mientras en la zona
baja (menos de 2.200 msnm), la cantidad de animales fue de 922; para
un total de 5.822 cabezas de raza Holstein – Mestizo y Criollo de varias
edades y grupos etarios para la fecha de la evaluación. Las ncas a ser
evaluadas poseían un total de 798 animales, distribuidos de la manera
siguiente: 103 toros, 286 vacas, 101 terneras, 99 terneros, 62 toretes
y 147 novillas, ubicadas en la zona de inuencia de la Universidad de
Cuenca en el Municipio Girón, facilitando de esa manera el acceso
al área y la toma de las muestras. La siguiente fórmula determinó la
cantidad de muestras requeridas para establecer una prevalencia:
FIGURA 1. Bovino Criollo, positivo a Babesia bigemina, animal macho de 16
meses de edad, ubicado a 2.790 m.s.n.m., en el municipio de Girón en Ecuador,
con signos compatibles a babesiosis bovina: fiebre alta (42,1ºC), grados
variables de hemólisis, anemia, inapetencia, debilidad, letargo, aumento de
la frecuencia respiratoria y cardíaca. Movilidad: Diferencia de altitud 95 m
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()
n
dN Zpq
NZ pq
1
22
2
##
#
###
=
-+
a
a
Donde:
n = tamaño de la muestra
Z = nivel de conanza (1,96)
p = probabilidad de éxito, o proporción esperada (0,0637)
q = probabilidad de fracaso (1 – 0,0637)
d = precisión del 5 %
El resultado de la muestra requerida considerando un nivel de
conanza del 95 % y asumiendo un error del 5 % fue de 91, sin embargo,
se trabajó con un total de 100 muestras.
,(.)., ,
.,,,
n
00558221 19600637 09363
5822 19600637 09363
91
22
2
###
## #
=
-+
=
Por lo tanto, del total de los 798 animales antes descritos, se
tomaron al azar 100 animales para ser sometidos a las pruebas
diagnósticas de la B. bigemina (frotis colereado con Giemsa, PCR
convencional, PCR–RFLP y qPCR–RT).
Toma de la muestra
Por punción en la vena yugular se tomaron 5 mL de sangre en tubos
impregnados con ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), a 100
bovinos pertenecientes a las Unidades de Producción Agropecuaria
(UPA) de dos niveles geomorfológicos, menor a 2.200 msnm (bajo)
y mayor a 2.200 msnm (alto), en el municipio Girón, localizado en
el callejón interandino de la República del Ecuador. Los animales
estudiados tenían características fenotípicas de ganado bovino
Mestizo – Holstein (MH) y Criollo (C) productores de leche, FIG.1.
Las muestras de sangre completa se analizaron mediante frotis
sanguíneos coloreados con Giemsa (tinción de Giemsa al 10 %
con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a un pH 7,4). Se
hicieron extensiones de sangre fresca obtenida por punción en la
cola agujas estériles de doble bisel y ayuda de campana Vacutainer
(BD Vacutainer®) y colocada en un tubo con anticoagulante ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA). La sangre se mantuvo refrigerada a
5°C (Nevera Indurama, Dos P, Indurama, Ecuador), hasta que se envió al
laboratorio. Las extensiones de sangre se secaron al aire, se jaron en
metanol absoluto durante 10–60 s, y se tiñeron con el colorante Giemsa
al 10 % durante 15–30 min. Las extensiones de sangre se prepararon
depositando una gota de sangre de unos 50 µL, sobre un porta objeto
de vidrio limpio, extendiéndola sobre una pequeña área mediante un
movimiento circular con la esquina de otro portaobjeto. Esta gota no
se jó con calor a 80°C durante 5 min. Luego se tiño con tinción de
Giemsa al 10 % [28].
Prueba PCR convencional
Protocolo de extracción de ADN de las muestras de sangre
A partir de sangre periférica, se realizó la extracción de ADN, según
la metodología descrita por Martínez–Mercado y col. [29]. Extraído
el ADN de las muestras, se cuanticó por espectrofotometría con
el equipo Nano Drop 2000 (Thermo® Scientic, USA), se programó
el equipo para cuantificación de ácidos nucleicos, se añadió la
solución blanca y nalmente se pipeteó 2 µL de la muestra para
medir la concentración y pureza de ADN. La vericación de la calidad
e integridad del ADN se evaluó mediante electroforesis en geles al
1.2 % de agarosa, teñido con Bromuro de Etidio (MP biomedicals®).
Finalmente se digitalizó la foto con la ayuda de un foto–documentador
(Transiluminador Bio Doc–It System®, Alemania).
Para la detección de babesias se realizó una PCR convencional utilizando
como cebadores especícos: PIRO A (5'–TACCCAATCCTGACACACAGGG–3')
y PIRO B (5'–TTAAATACACGAATGCCCCCCCAAC–3') [21, 28]. Estos
amplican parcialmente el gen 18S rARN de Babesia spp., mostrando
una banda de aproximadamente 400 pb del ácido ribonucleico
ribosómico de subunidad pequeña (SSU–rARN) de la mayoría de
especies de Babesia [30]. La capacidad de los cebadores combinados
PIRO–A y PIROB para discriminar especies de Babesia se analizó
mediante un ensayo de PCR con el cual es posible distinguir B. bovis,
B. bigemina y B. microti debido a que los productos amplicados
muestran un polimorsmo de tamaño diferente de 390, 395 y 408pb,
respectivamente [31].
Se utilizó PCR convencional para detectar, a partir del ADN
en regiones variables del gen 18S rARN, la banda de 395 pb
correspondiente a la B. bigemina. Los reactivos y volúmenes de
reacción utilizados y los ciclos de temperatura empleados en la
amplicación PCR convencional se describen en la TABLA I. Luego
de la desnaturalización inicial a 94°C por 5 min, se aplicaron 40
ciclos (Desnaturalización: 94°C por 30 s, Alineación: 52°C por 40 s y
Extensión nal: 68°C por 5 min).
Ensayo PCR–RFLP de los productos PCR y visualización
Para este ensayo se utilizaron los productos amplicados PCR
de 395 pb (almacenados a -20°C). Se adicionó a los productos PCR
1,5µL de la enzima de digestión Alu I (Thermo Scientic 10 U·µL
-1
) y
4µL de Buffer Tango 10× con BSA (Thermo Scientic 1mL: 33 mM Tris
-acetato (pH 7,9 a 37°C), 10 mM acetato de magnesio, 66 mM acetato
de potasio, 0.1 mg·mL
-1
BSA). Mezclando con vortex por 6 a 7 s. Y para
FIGURA 2. Fragmentos resultantes de la digestión enzimática con Alu I del
ADN ribosomal de Babesia: A. Babesia bigemina; fragmentos de 38, 144 y 211
pb. Reporte cepa OL583937.1 de la U Cuenca; Lab. Biogen, Ecuador
Análisis epidemiológico y molecular de la babesiosis en bovinos / Bustamante-Ordóñez y cols.____________________________________
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el control negativo se adicionó 5 µL de agua grado biología molecular
en un tubo para PCR.
Se colocó en la incubadora bacteriológica (Selecta, 3000957,
Selecta, España) para la reacción de ligación por 1 a 2 horas a
37°C. Concluido el proceso de digestión, se procedió a realizar la
electroforesis en gel de agarosa al 1,2 % (Invitrogen, N° cat; 16500–
500), siguiendo el procedimiento descrito en el punto anterior. En
cada muestra se añadieron 3 µL de buffer de carga (40 mM de Tris–
acetato, 1 mM de EDTA) (Sigma, N° cat: T4661, A6283, EDS, S8045) y
se mezcló mediante vortex por 6 s. En los pocillos del gel se colocaron
18 µL de cada muestra, 5 µL de control negativo y 5 µL de marcador
de peso molecular para ADN. Sellada correctamente, la cámara de
electroforesis se conectó a la fuente de poder ajustando el voltaje a
80V por 1 hora. Una vez terminado el proceso se realizó la visualización
correspondiente. En el caso del ensayo PCR–RFLP, la enzima de
restricción Alu I con su secuencia de reconocimiento 5' AG↓CT 3'; 3'
TC↑GA 5', corta los amplicones de ADN de B. bigemina en fragmentos
aproximadamente de 38, 144 y 211 bp, [31] FIG.2.
La técnica PCR en tiempo real (qPCR–RT)
Amplica y cuantica un fragmento de ADN especíco. El ADN
amplicado se cuantica a medida que se genera (en “tiempo real”),
por lo que determina si una secuencia especíca presente en la
muestra y también determina el número de copias de esa secuencia.
No se requiere análisis post–PCR, por lo tanto, es más rápida y no
genera gastos por análisis electroforéticos o fotodocumentación
(Bio Rad, Model: Gel Doc XR+, USA) [17, 32].
Para la amplificación en tiempo real (qPCR–RT) se utilizó el
kit comercial qPCR Primerdesign para B. bigemina [16]. Con la
introducción del método de qPCR se ha logrado la detección de
ganado portador infectado con B. bovis y B. bigemina, especialmente
con un límite inferior de detección de 0,0000001 % de glóbulos rojos
infectados circulantes por mililitro (IRBC·mL
-1
) [33], mejorando el
diagnóstico de la babesiosis bovina y permitiendo cuanticar los
niveles de infección en animales portadores, con una alta sensibilidad,
especicidad y precisión analítica [15, 16, 25].
Factores de riesgo
Con encuestas epidemiológicas se determinaron los factores de
riesgo (FR) siendo las más importantes: altitud (msnm.): menos de
2.200 y mas de 2.200 msnm, movilidad (mts): menos de 350 y más de
350 mts, raza: criollo o mestizo, sexo: macho o hembra, edad: menos
de 12 o mayor a 12 meses, carga del vector: Baja (menor a 50·animal
-1
)
o alta (mayor a 50·animal
-1
), frecuencia de baños garrapaticidas:
menor a 60 o mayor a 60 días y época de año: verano e invierno. Para
identicar el número de garrapatas se revisó el lado izquierdo de los
animales utilizando los métodos visuales indirecto, palpatorio y visual
directo de forma secuencial en cada animal [9].
Georreferenciación
La distribución de los casos positivos por intervalos de altitud se
calculó aplicando la regla de Sturges creada en 1926 por el estadístico
alemán Herbert Sturges según la fórmula c = 1+ log
2
(N), donde c es el
número de clases o intervalos y N es el número total de observaciones
de la muestra [34].
Finalmente se diseñó y se elaboró un mapa georreferenciado
del municipio Girón, Azuay, Ecuador en el cual se reseñaron
grácamente los casos de animales positivos a B. bigemina por niveles
geomorfológicos, fundamentados en resultados con las técnicas de
Frotis coloreado con Giemsa, PCR–RFLP y qPCR–RT.
Análisis estadísticos
Se utilizó un diseño no experimental en el cual la presencia de
Babesia spp. fue evidenciada en un total de 100 animales, cada
uno monitoreado mediante frotis coloreados con Giemsa, PCR
convencional, PCR–RFLP (variables cualitativas) y qPCR–RT (Variables
cuali–cuantitativas), de acuerdo al cálculo estadístico del tamaño de
la muestra. Los resultados positivos para Babesia spp. obtenidos por
pruebas moleculares fueron discriminados mediante la presencia
de bandas amplicadas, mientras que los resultados negativos
por la ausencia de bandas. Se utilizaron pruebas no paramétricas
para variable de respuesta cualitativas. La prueba estadística
para determinar si existía asociación entre los factores de riesgo
fue el Ji cuadrado. Como variables se obtuvieron la presencia y
prevalencia del agente patógeno en cuestión. Los errores generados
en la investigación fueron generados únicamente por los factores
ambientales y/o errores del operador.
Los análisis realizados en la investigación fueron analizados
mediante el software estadístico Microsoft Excel y SPSS. Los
datos generados en los registros y encuestas, además de los datos
obtenidos en el laboratorio arrojaron distribuciones de frecuencias y
TABLA I
Reactivos y volúmenes por reacción empleados
para el proceso de amplicación
Reactivo Concentración
Volumen por
reacción
Agua grado molecular
No aplica 79,5 μL
Buer de amplicación
10× 12,5 μL
Solución enhancer
10× 12,5 μL
MgSO
4
50 mM 5 μL
dNTP's
10 mM c/u 2,5 μL
Oligonucleótido Bspp 18s For
μM 1 μL
Oligonucleótido Bspp 18s Rev
μM 1 μL
Enzima Pfx ADN polimerasa
2,5 U·μL
-1
1 μL
Muestra de ADN total
ng·μL
-1
10 μL
A
B
FIGURA 3. A: Rhipicephalus microplus. Vista dorsal; FUENTE: Universidad de El
Salvador, adaptado de Canestrini, 1877. B: Rhipicepalus (Boophilus) microplus.
Vista dorsal de garrapatas tomadas de bovinos ubicados a 2.810 msnm en
el municipio de Girón en Ecuador
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medidas de tendencia central. Los datos de prevalencia se calcularon
con la fórmula:
Prevalencia puntual = Ct/Nt
De dónde: Ct = número de casos positivos para Babesia spp. y Nt =
número total de animales muestreados en la población.
La prevalencia de los patógenos en esta investigación se la calculó
mediante los resultados de cada una de las técnicas utilizadas para el
diagnóstico. Gracias a los datos que arrojó la estadística descriptiva
se llevaron a cabo pruebas de Ji cuadrado (nivel de signicancia
P<0,05) para comparar la prevalencia de Babesia spp. con los factores
de riesgo evaluados.
Para los FR se utilizó la medida epidemiológica Odds Ratio (OR)
en función de los registros y encuestas realizadas cotejadas con las
pruebas de laboratorio, donde se detallaron ciertos FR que podrían
inuir en la presencia o no de Babesia spp. La presente investigación
es un estudio de tipo transversal. la fuerza de asociación entre el
factor de riesgo y la presentación del evento (OR) se calculó mediante
la formula siguiente: OR = A × d/b × C (Asociación con daño o
riesgo de infección cuando OR > 1). Se utilizó el modelo logístico de
regresión para determinar los intervalos de conanza para los OR. La
oportunidad de riesgo del factor aumenta o disminuye en función de
que el intervalo de conanza sea mayor o menor a 1, respectivamente.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las garrapatas encontradas en este estudio presentaron
características taxonómicas de R. microplus, según se reseña en
el catálogo de garrapatas publicado por Universidad de El Salvador,
Facultad de Ciencias Agronómicas, Departamento de Medicina
Veterinaria. Ministerio de Agricultura y Ganadería (MAG) y la Red de
Laboratorios Veterinarios de ese país [35] FIG. 3.
Las garrapatas estuvieron presentes en todos los animales
evaluados con recuentos de menos de 50 a más de 50 ejemplares por
animal, En las zonas baja (menor a 2.200 msnm), no hubo diferencias
entre ambos intervalos. En la zona alta (mayor a 2.200 msnm), por
el contrario, prevalecieron los recuentos menores a 50 ejemplares
por animal, TABLA II.
TABLA II
Recuento de garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus infestando
bovinos del municipio Girón, Azuay en intervalos bajos y altos
Intervalo
(msnm)
Recuento de garrapatas
(< 50·animal
-1
) (> 50·animal
-1
) Total
Número de
animales
< 2.200 29 24 53
> 2.200 43 4 47
Total
72 28 100
72,0 % 28,0 % 100,0 %
Se pudo corroborar la presencia de la garrapata R. microplus en
altitudes mayores a 2.200 msnm [35]. Posiblemente en esta zona
alta la temperatura ambiental inuyó en el proceso de adaptación
de la garrapata donde la fase de desarrollo puede extenderse (120
días) a temperaturas de 18°C [35].
Benavides–Ortíz y col. [36], reportó recientemente la primera
caracterización molecular de B. bigemina y B. bovis en Ecuador.
Siendo está también la primera evidencia de Babesia spp. en bovinos
de la zona de Quito a una altitud de 2.469 msnm., siendo la mayor
altitud reportada para animales con babesiosis y para la garrapata
R. microplus en este país. Estos Autores, indicaron que los factores
climáticos, así como la movilidad de los animales portadores de
garrapatas, sin ningún tipo de control, permitieron la presencia de
brotes de Babesiosis en esas nuevas áreas geográcas. A la ciudad de
Quito llegan bovinos provenientes de diversas regiones del país para
ser faenados en centros de sacricio, muchos de ellos portadores de
ectoparásitos. Esta movilidad sin control puede introducir garrapatas
a los pastos ocasionalmente, provocando una inestabilidad enzoótica
para estos hemoparásitos.
Utilizando frotis sanguíneos coloreados con Giemsa se identicaron
en promedio 16 % de muestras positivas a B. bigemina, 7,54 %,
ubicación menor a 2.200 msnm y 25,53 %, ubicación mayor a 2.200
msnm. El mayor número de positivos se ubicó entre los niveles
2.083–2.350 msnm, FIG. 4, TABLA III.
Por PCR–RFLP, la prevalencia se ubicó en un 11 % TABLA III.
En la FIG.5 se observan los resultados de la electroforesis en gel
agarosa al 1,2 %, en los pocillos 40 y 61 mostrando la banda en 393 pb
correspondiente a la B. bigémina. En el extremo derecho de la misma
gura se encuentra el marcador de peso molecular, mismo que sirve
de guía para determinar el sitio de amplicación, siendo las bandas
más intensas consideradas como positivas.
Mediante el ensayo RFLP se realizó la digestión enzimática
empleando la enzima de restricción Alu I del fragmento de 393 bp
obtenido por PCR convencional, conrmando así, como positivas las
11 muestras reaccionante con el PCR convencional, mostrando dos de
los tres fragmentos esperados de 144 pb y 211 pb para B. bigemina. En
FIGURA 4. Frotis sanguíneo coloreado con Giemsa mostrando glóbulos rojos
infectados con B. bigemina
FIGURA 5. Electroforesis de los productos PCR para Babesia bigemina 393pb.
Carriles 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7; muestras 40 (positiva), 61(positiva), 62, 66, 72,
73 (negativas); respectivamente. Carril C– control negativo. Carril MPM
Marcador de peso molecular de 100pb
FIGURA 6. Digestión enzimática con la enzima Alu I. Se indica los fragmentos
144 pb y 211 pb para Babesia bigemina. Carriles 1, 2, 3 muestras 46, 54 y 82,
respectivamente. Carril MPM marcador de peso molecular de 100 pb. *El
fragmento de 38 pb esperado no se observó en el gel
FIGURA 7. Nivel de umbral y valor de Cq en una curva de amplicación por
muestra donde se indica cuantos ciclos se necesitaron para detectar el
aumento de la uorescencia. Los valores más bajos de Cq indican cantidades
altas de la secuencia, mientras que los valores más altos signican cantidades
bajas del ácido nucleico. De acuerdo con las instrucciones del kit Primer
Design, una curva de tipo S con Cq ≤ 35 representa un resultado positivo.
Análisis epidemiológico y molecular de la babesiosis en bovinos / Bustamante-Ordóñez y cols.____________________________________
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la FIG.6 se muestran los resultados de la electroforesis en gel agarosa
al 1,2 %, en los pocillos 46, 54 y 82 revelando las bandas de 211 pb y
144 pb, conrmatorias de la B.bigémina. En el extremo derecho de
la misma gura se encuentra el marcador de peso molecular, mismo
que sirve de guía para determinar el sitio de amplicación, siendo
las bandas más intensas consideradas como positivas.
TABLA III
Prevalencias de Babesia bigemina por niveles altitudinales
establecidas con las tecnicas de frotis Giemsa, PCR–RFLP y qPCR–RT
Técnicas Frotis Giemsa PRC–RFLP qPCR–RT
Número de
muestras
Intervalos
(msnm)
(+) (–) (+) (–) (+) (–)
< 2.200
4
(7,54 %)
49
(92,45 %)
5
(9,43 %)
48
(90,56 %)
29
(54,72 %)
24
(45,28 %)
53
> 2.200
12
(25,53 %)
35
(74,46 %)
6
(12,76 %)
41
(87,23 %)
14
(29,79 %)
33
(70,21 %)
47
Total
%
16 84 11 89 53 47 100
16 % 84 % 11 % 89 % 53 % 47 % 100 %
Con el diagnóstico molecular PCR–RFLP, la prevalencia total se
ubicó igualmente en 11 %. En 53 animales en el nivel menor a 2200
msnm, se obtuvo una prevalencia de 9,43 % y en 47 animales del nivel
mayor a 2.200 msnm, la prevalencia se ubicó en 12,76 %, TABLA III.
Mientras que con el método qPCR–RT se obtuvo una prevalencia del
43 % de B. bigemina con un 54,72 % en el nivel menor a 2.200 msnm
y 29,79 % en el nivel mayor a 2.200 msnm., la cual superó en mucho
los resultados obtenidos con las técnicas de frotis directo en sangre
coloreado con Giemsa y PCR–RFLP, TABLA III.
En la FIG. 7 y TABLA IV se muestran las curvas de amplicación
de las muestras y sus respectivos valores Cq oscilando entre 15,7 y
34,5, dando como resultado un total de 43 positivas, y cuyos valores
individuales se detallan en la TABLA V.
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Las muestras positivas a B. bigemina presentaron un Cq entre 15,7
y 34,5, con un mayor rango de valores de parasitemia estimado entre
10
2
y 10
7
copias·µL
-1
, TABLA IV, ubicándose la mayoría de las muestras
(18 muestras) en parasitemias de 10
3
copias·µL
-1
, TABLA V, su mayoría
ubicadas a menos de 2.200 msnm, TABLA VI.
(OR > 1 y P<0,05) relacionadas con daño, con la altitudes mayores a
2.200 msnm, las cuales coincidieron con mayor número de animales
con parasitemias bajas en esas zonas. Otros factores asociados a daño
fueron la carga alta de vectores (más de 50 garrapatas por animal)
frecuencias de baños garrapaticidas menos de 60 días y en la época de
verano, los cuales propiciaron incremento signicativo de la presencia
de B. bigemina en las zonas bajas del municipio Girón, TABLA VII.
TABLA IV
Resultado de la Técnica qPCR–RT para diagnóstico Babesia bigemina (Intervalo Positividad Cq: 15–35) y Parasitemia
N° Muestra 2 7 9 10 11 14 15 22 23 24 25 27 28 30 31
Cq 34,5 27,0 30,9 34,2 32,0 34,3 26,6 31,5 31,0 22,8 27,0 25,4 32,2 31,6 32,1
Copias·µL
-1
10
2
10
4
10
3
10
2
10
3
10
2
10
5
10
3
10
3
10
6
10
5
10
5
10
3
10
3
10
3
N° Muestra 32 33 34 35 42 43 46 47 53 55 56 57 58 59 60
Cq 26,7 27,3 33,2 29,1 30,6 33,2 15,7 31,9 29 31,9 30,6 28,7 32 25 28,9
Copias·µL
-1
10
5
10
4
10
2
10
4
10
3
10
2
10
7
10
3
10
4
10
3
10
3
10
4
10
3
10
5
10
4
N° Muestra 64 66 67 68 71 74 77 78 79 80 90 92 96
Cq 32,4 29,2 27,3 32,2 23,3 32,6 30,9 25,9 32,3 29,9 32,7 33,9 25,3
Copias·µL
-1
10
3
10
4
10
5
10
3
10
5
10
3
10
3
10
4
10
3
10
3
10
2
10
2
10
4
TABLA V
Grado de parasitemia a Babesia bigemina
según cantidad de muestras evaluadas
Copias·µL
-1
Nº de muestras positivas
10
2
7
10
3
18
10
4
9
10
5
7
10
6
1
10
7
1
Total 43
Estos niveles de parasitemia son característicos de bovinos
portadores de estos hemoparásitos en áreas endémicas [26, 37, 38],
por lo que pueden ser sucientes para la infección de las garrapatas
que se alimentan de estos animales infectados, permitiendo así
la transmisión biológica de estos protozoos desde los animales
portadores, sin embargo, la infecciosidad de estos huéspedes debe
analizarse, según los autores, en futuras investigaciones [39].
Solo la técnica de qPCR–RT permitió asociar los factores de riesgo
a la infección con B.bigémina, mostrando asociaciones signicativas
TABLA VI
Resultado de la técnica qPCR–RT para diagnóstico
Babesia bigemina según niveles de altitud
Parasitemia (Nº copias·µL
-1
)
Altitud
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
10
7
< 2.200 msnm
4 12 6 5 2 1
> 2.200 msnm
3 6 3 2 0 0
TABLA VII
Asociación de la infección con Babesia bigemina y
diversos factores de riesgo en el municipio Girón, Azuay,
Ecuador evaluados con la técnica qPCR–RT
Factores
Asociados
Intervalos
Intervalo de
conanza al 95 %
gl P–value
Odds
Ratio
Inferior Superior
Altitud < 2.200 msnm 1,096 2,885 1 0,015 2,65 Sig.
Carga
Vector Alta
> 50 garrapatas
/ animal
1,016 1,754 1 0,023 1,21 Sig.
Época
del Año
Verano 1,081 3,410 1 0,014 2,81 Sig.
Frecuencia
– Baños
> 60 días 1,539 7,488 1 0,010 5,55 Sig.
Estos factores deben ser tomados en cuenta por el Médico
Veterinario y el productor, en el momento de plantearse un programa
de control de la babesiosis bovina que incluya monitoreo para el
diagnóstico de B.bigémina en las zonas bajas del municipio, donde
se ubican la mayor cantidad de animales positivos con bajas
parasitemias, característica de las zonas con estabilidad enzoótica.
La alta carga de vectores debe ser controlada una frecuencia de
baños garrapaticidas mayor a 60 días de intervalo para evitar la
esterilización del vector, especialmente en la época de verano cuando
se incrementan las cifras de animales positivos a Babesia.
Las técnicas moleculares se utilizan cada vez más para diagnosticar
enfermedades, principalmente por su alta sensibilidad y especicidad
[16, 30, 33]. Sin embargo, las pruebas de PCR convencionales
solo permiten la detección cualitativa de la infección y requieren
concentraciones importantes del ADN parasitario. Por el contrario,
la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real supera estos límites;
FIGURA 8. Georreferenciación municipio Girón, Ecuador. Casos Babesia
bigemina en bovinos conrmados por Frotis coloreados con Giemsa, PCR–
RFLR y RT–PCR
Análisis epidemiológico y molecular de la babesiosis en bovinos / Bustamante-Ordóñez y cols.____________________________________
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además de ofrecer una opción diagnóstica más sencilla y eciente,
permitiendo cuanticar el número de copias de fragmentos de ADN
de Babesia spp., detectando concentraciones de hasta 10
2
copias·µL
-1
,
partiendo de muestras extraídas directamente de sangre bovina.
Utilizando esta técnica, se reportaron diferencias signicativas en
los niveles de infección por B. bovis en animales de diferentes edades
y grupos genéticos (Bos taurus y Bos indicus) [40].
La FIG. 8 muestra en un mapa georreferenciado del municipio Girón,
Azuay, Ecuador, la ubicación de los casos de B. bigémina detectados
a partir de 100 muestras de bovinos en varios niveles de explotación
pudiéndose apreciar que la mayoría de los animales infectados se
encuentran por debajo de los 2.200 msnm. Para la elaboración de este
mapa georeferenciado se utilizaron los resultados obtenidos según
las reglas de Sturges de la distribución de muestras positivas a B.
bigémina por técnica e intervalos de altitud. La mayoría de las técnicas
coinciden en que el mayor número de animales positivos a B.bigemina
se encuentran en el intervalo 2.083–2.350 msnm, TABLA VIII.
CONCLUSIONES E IMPLICACIONES
Fue conrmada la ubicación de garrapatas R. microplus infestando
bovinos en altitudes mayores a 2.200 msnm en el municipio Girón
de la provincia de Azuay Ecuador, provenientes de zonas bajas con
infestaciones mayor a 50 y menor a 50 garrapatas por animal. Las
zonas altas muestran mayor cantidad de animales con baja carga
de garrapatas característico de zonas con inestabilidad enzoótica.
Con las técnicas de frotis sanguíneo coloreado con Giemsa
y PCR–RFLP no fue posible diagnosticar un alto porcentaje de
animales infectados con B. bigemina en las zonas bajas con relativa
estabilidad enzoótica. Utilizando qPCR–RT, por el contrario, se
lograron diagnosticar en la zona baja, un mayor número de animales
positivos a B. bigémina, aunque con una baja parasitemia (10
2
– 10
3
copia·µL
-1
). La presencia de B. bigemina se asoció además con carga
alta de vectores de más de 50 garrapatas por animal, frecuencia
de baños garrapaticidas menor a 60 días y en la época de verano,
cuando se incrementó signicativamente la presencia de B. bigemina,
ubicándose la prevalencia general real del municipio Girón en 43 %.
Queda demostrado que la técnica qPCR–RT amplica y cuantica
fragmentos de ADN especícos de B. bigemina. Es más rápida, directa
y no se requieren análisis electroforéticos o fotodocumentación
posteriores, simplicando el trabajo de laboratorio con un análisis
más sensible y especíco.
La presencia de la B. bigemina y su trasmisor la garrapata R.
microplus, se encuentran presentes a todos los niveles del territorio
ocupado por el municipio Girón de la provincia de Azuay en Ecuador
en sus diferentes niveles geomorfológicos.
Se recomienda aplicar las técnicas moleculares de qPCR–RT para
reevaluar las prevalencias de animales infectados con Babesia con
técnicas tradicionales, como frotis sanguíneo e inclusive PCR–RFLP,
previamente publicadas para otras regiones del Ecuador, con el n de
poder ajustar los números de pérdidas y lograr así tomar las medidas
necesarias de control en los bovinos afectados con babesias. Igualmente,
se hace necesario genotipicar las cepas de B. bigemina aisladas de la
zona y hacer los estudios epidemiológicos moleculares comparativos
con el resto de las cepas ya secuenciadas y registradas en el Ecuador.
Conictos de interés
Los autores declaran, que no existe conicto de intereses, en el
presente trabajo.
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TABLA VIII
Muestras positivas a Babesia bigemina detectadas por
las tecnicas de frotis Giemsa, PCR–RFLP y qPCR–RT según
intervalos de altitud calculados bajo reglas Sturges
Técnicas
Frotis con
Giemsa
PCR–RFLP qPCR–RT
Total
muestras
Intervalos
(msnm)
(–) (+) (–) (+) (–) (+)
1.010–1.278 4 0 4 0 2 2 4
1.547–1.814 2 0 2 0 0 2 2
1.815–2.082 11 2 11 2 7 6 13
2.083–2.350 42 9 43 8 29 22 51
2.351–2.618 12 2 13 1 11 3 14
2.619–2.886 13 2 15 0 7 8 15
2.887–3.154 0 1 1 0 2 2 1
Total
84 16 89 11 57 43 100
84 % 16 % 89 % 11 % 57 % 43 % 100 %
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