Revista Cienﬁca, FCV-LUZ / Vol. XXXV Recibido:15/03/2025 Aceptado: 05/05/2025 Publicado: 05/06/2025 hps://doi.org/10.52973/rcfcv-e35652 UNIVERSIDAD DEL ZULIA Serbiluz Sistema de Servicios Bibliotecarios y de Información Biblioteca Digital Repositorio Académico 1 of 6 Caracterización fenopica de un cerdo con cariopo XX y genitales ambiguos: Evidencia citogenéca, endocrina e histopatológica Phenotypic characterizaon of a pig with XX karyotype and ambiguous genitalia: Cytogenec, endocrine, and histopathological evidence. *Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Técnica de Machala, Av. Panamericana km 5.5, Vía Pasaje, Machala 070150, Ecuador RESUMEN El síndrome del varón XX es una enfermedad genéca rara en humanos, caracterizada por la presencia de genitales masculinos o ambiguos en individuos que pesentan un cariopo femenino (2n = 44 + XX). Este síndrome se atribuye, en la mayoría de los casos, a la traslocación del gen SRY del cromosoma desde el cromosoma Y al X; sin embargo, en algunos individuos no se detecta SRY, lo que sugiere mecanismos alternavos como el quimerismo o el mosaicismo. En el cerdo (Sus scrofa domesca), la diferenciación sexual también depende de la presencia funcional del gen SRY. En esta invesgación se describe el caso de un cerdo de 6 meses de edad con cariopo 2n = 36 + XX y genitales ambiguos, encontrado en una granja de Piñas, Ecuador. Se realizaron estudios citogenécos, endocrinos y anatómicos (macroscópicos e histopatológicos) y necropsia con el objeto de caracterizar el síndrome observado. Los análisis citogenécos revelaron un cariopo femenino normal, sin evidencias de aberraciones cromosómicas numéricas ni estructurales, mientras que los estudios hormonales mostraron niveles apicos de testosterona y estradiol. La necropsia y el examen histológico permieron idenﬁcarn anomalías en los órganos reproductores y en el sistema urinario. Este caso subraya la importancia de conocer y caracterizar las anomalías del desarrollo sexual en cerdos tanto para el diagnósco clínico como para la comprensión de los mecanismos genécos subyacentes. Palabras clave: Análisis citogenéco; cerdos intersexuales; reversión sexual XX; translocación del gen SRY; trastornos del desarrollo sexual (DSD) ABSTRACT XX male syndrome is a rare genec disorder in humans, characterized by the presence of male or ambiguous genitalia in individuals with a female karyotype (2n = 44 + XX). This syndrome is most commonly aributed to the translocaon of the SRY gene from the Y chromosome to the X chromosome; however, in some individuals, the SRY gene is not detected, suggesng alternave mechanisms such as chimerism or mosaicism. In pigs (Sus scrofa domesca), sexual diﬀerenaon also depends on the funconal presence of the SRY gene. This study describes the case of a six-month-old pig with a 2n = 36 + XX karyotype and ambiguous genitalia, found on a farm in Piñas, Ecuador. Cytogenec, endocrine, anatomical (macroscopic and histopathological), and necropsy studies were conducted to characterize the syndrome observed. Cytogenec analyses revealed a normal female karyotype without evidence of numerical or structural chromosomal abnormalies, while hormonal evaluaons showed atypical levels of testosterone and estradiol. Necropsy and histological examinaon idenﬁed abnormalies in the reproducve organs and urinary system. This case highlights the importance of recognizing and characterizing disorders of sexual development in pigs, both for clinical diagnosis and for a deeper understanding of the underlying genec mechanisms. Key words: Cytogenec analysis; intersex pigs; SRY gene translocaon; XX sex reversal; disorders of sexual development (DSD). Guido Manuel Apolo-Arevalo , Lorena Elizabeth Chalco-Torres* , Robert Gustavo Sánchez-Prado, Mauro Nirchio-Tursellino

Revista Cienﬁca, FCV-LUZ / Vol. XXXV UNIVERSIDAD DEL ZULIA Serbiluz Sistema de Servicios Bibliotecarios y de Información Biblioteca Digital Repositorio Académico INTRODUCCIÓN En mamíferos la diferenciación sexual está determinada por los cromosomas sexuales (XX o XY) y la presencia del gen SRY, que induce el desarrollo tescular y la diferenciación masculina. En ausencia de SRY, se inicia la diferenciación ovárica y el desarrollo de un fenopo femenino [1]. Sin embargo, este modelo binario es desaﬁado por condiciones como el síndrome del varón XX en humanos y los trastornos del desarrollo sexual XX (2n = 36 + XX DSD), eso es, diferencias en el desarrollo sexual en cerdos, que implican alteraciones en la diferenciación gonadal, cromosómica o anatómica [2]. En humanos, el síndrome del varón XX suele deberse a la translocación del gen SRY al cromosoma X, aunque en algunos casos se han idenﬁcado otros mecanismos, como quimerismo, mosaicismo o mutaciones autosómicas [3 ,4]. En cerdos, aunque estas condiciones han sido menos estudiadas, representan un desao para la producción porcina. El XX DSD se asocia con genitales ambiguos, disfunción reproducva y alteraciones en el comportamiento, lo que afecta la calidad de la canal y la rentabilidad en sistemas de cría comercial [5 , 6]. Su prevalencia, en la mayoría de las poblaciones, alcanza hasta un 20% en líneas endogámicas [7]. Sin embargo, los mecanismos genécos y del desarrollo subyacentes a esta condición aún no han sido completamente caracterizados. Aunque el XX DSD en cerdos ha sido reportado previamente, la variabilidad fenopica de esta condición sigue sin comprenderse completamente. La integración de hallazgos citogenécos, hormonales e histopatológicos es clave para su caracterización. En parcular, la evaluación del perﬁl hormonal y la posible ausencia de translocación del gen SRY resaltan la necesidad de explorar mecanismos alternavos de diferenciación sexual en cerdos. Además, el impacto del XX DSD en la ferlidad, el comportamiento y la calidad de la carne refuerza la importancia de estudiar estos casos en profundidad [8 , 9]. Este estudio presenta el caso de un cerdo domésco de seis meses de edad con genitales ambiguos y cariopo XX. Mediante evaluaciones clínicas, hormonales, citogenécas e histológicas, se busca aportar información sobre las bases genécas y del desarrollo del XX DSD y sus implicaciones en la producción y el manejo genéco en porcicultura. MATERIALES Y MÉTODOS El cerdo afectado fue obtenido de una granja comercial en Piñas, Ecuador, donde la reproducción se lleva a cabo sin pruebas genécas para trastornos del desarrollo sexual. No se disponía de información sobre la consanguinidad de los progenitores, lo que representa una limitación para evaluar posibles factores hereditarios como la presencia de genes recesivos. Sin embargo, estudios previos sugieren una base genéca para el XX DSD en cerdos, con esmaciones de heredabilidad que oscilan entre 0,72 y 0,81. Esto respalda la existencia de una base genéca adiva [10]. Análisis hormonal El perﬁl hormonal se determinó mediante inmunoensayos de electroquimioluminiscencia ulizando un analizador Cobas e411 (Roche Diagnoscs). Se midieron los niveles séricos de testosterona, estradiol y progesterona para evaluar la función gonadal. Las muestras fueron obtenidas por punción venosa yugular en las primeras horas de la mañana para minimizar variaciones circadianas. Posteriormente, el suero fue separado por centrifugación a 1,500 × g durante 10 min y almacenado a -80°C hasta su análisis. Los resultados se compararon con los rangos de referencia establecidos para cerdos normales macho (2n = 36 + XY) y hembra (2n = 36 + XX), respecvamente. Análisis citogenéco El cariopo se obtuvo siguiendo el protocolo descrito por Guerrero et al. [10]. La capa de leucocitos de la muestra se inoculó en medio de cariopado PB-MAX (Gibco™) y se incubó durante 72 horas a 38°C. Posteriormente, se añadieron 85 µl de colchicina al 0,0125% y se incubó a 38 °C durante 45 minutos para detener las células en metafase. El culvo fue centrifugado a 168 × g por min durante 10 min, y el sobrenadante fue descartado. El precipitado celular se suspendió en un volumen igual de solución hipotónica (0,075 M KCl) y se incubó durante 20 min a 38°C. Después del tratamiento hipotónico, las células fueron centrifugadas nuevamente, se eliminó el sobrenadante y se realizaron tres lavados con ﬁjador de metanol-ácido acéco (3:1 v:v). Finalmente, las células fueron suspendidas en 1 mL de ﬁjador. Los portaobjetos se secaron al aire y se ñeron con Giemsa para la evaluación del cariopo convencional. Para el bandeo G los extendidos celulares fueron tratados con tripsina y teñidos con Giemsa, siguiendo el protocolo descrito por Lawce [11]. El análisis cromosómico se realizó ulizando un microscopio Olympus BX53 (Olympus Corporaon, Ishikawa, Japón) equipado con una cámara digital Olympus DP73 acoplada al soﬅware cellSens Dimension (Olympus) para la adquisición de imágenes, y los cariopos se ensamblaron mediante el soﬅware de procesamiento de imágenes digitales Adobe Photoshop (Adobe Systems, Inc. San José, California, Version 2015.0.0). Los cariopos se organizaron según la relación de brazos cromosómicos [12]. Se analizaron al menos 100 metafases para conﬁrmar el complemento cromosómico y descartar la presencia de mosaicismo o anomalías estructurales. Procedimiento de necropsia El cerdo fue eutanasiado siguiendo las directrices de la American Veterinary Medical Associaon para la Eutanasia de Animales [13], mediante la administración intravenosa de pentobarbital sódico a una dosis de 90 mg/kg. Posteriormente se realizó una necropsia completa, con examen detallado de los genitales externos, las estructuras urogenitales y los órganos accesorios en busca de anomalías. Las estructuras internas fueron disecadas y fotograﬁadas, y se recolectaron muestras para análisis histopatológico. Se documentaron observaciones macroscópicas, incluyendo la presencia de estructuras accesorias en la vejiga, gónadas rudimentarias y cualquier otra anomalía adicional. Análisis histológico Los tejidos recolectados durante la necropsia, incluidos tesculos, epidídimo, estructuras similares al útero y riñones, fueron ﬁjados en formalina tamponada al 10% durante 48 h, procesados e incluidos en paraﬁna. Se obtuvieron secciones de 4-5 μm de grosor, que fueron teñidas con hematoxilina y eosina para su evaluación histopatológica. El tejido tescular fue examinado para evaluar la presencia y estructura de los túbulos 2 of 6

Caracterización fenopica de un cerdo con cariopo XX / Apolo y cols. UNIVERSIDAD DEL ZULIA Serbiluz Sistema de Servicios Bibliotecarios y de Información Biblioteca Digital Repositorio Académico seminíferos, células de Sertoli, células de Leydig y acvidad espermatogénica. Las estructuras similares al útero fueron analizadas en busca de endometrio glandular, lámina propia y capas miometriales. El tejido renal se evaluó para determinar la integridad glomerular y tubular. Análisis de datos Todos los datos fueron analizados cualitavamente, centrándose en los hallazgos citogenécos e histopatológicos. Los niveles hormonales se compararon con valores de referencia para cerdos XY y XX con el ﬁn de proporcionar información sobre el estado funcional de los tejidos gonadales. Se correlacionaron las observaciones para evaluar las anomalías fenopicas y genopicas, proporcionando una caracterización integral de la condición. Declaración éca Todos los procedimientos realizados con el animal en este estudio cumplieron con las normavas instucionales e inter- nacionales para el tratamiento éco de los animales. El estudio fue aprobado por el Comité de Éca en Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad Técnica de Machala bajo el número de protocolo CEEA-UTM-2024-001. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El examen sico del cerdo reveló anomalías signiﬁcavas en las estructuras reproducvas masculinas. Se observó un abultamiento prominente de tejido adiposo, consistente con un pliegue prepucial vesgial, ubicado caudal a la cicatriz umbilical, sin la presencia de un oriﬁcio o bolsa prepucial (FIG. 1a). Un pene rudimentario, de aproximadamente 6 cm de longitud se encontraba anómalamente posicionado en la región perineal y presentaba una uretra estrecha parcialmente encerrada dentro de un falso prepucio (FIG. 1c). Además, se idenﬁcó una bolsa escrotal subdesarrollada que contenía un tesculo atroﬁado en la misma región (FIG. 1b). La necropsia conﬁrmó estos hallazgos clínicos y proporcionó detalles anatómicos adicionales (FIG. 2). El sistema urogenital consisa en dos riñones anatómicamente normales, cada uno con un uréter único conectado a una vejiga urinaria primaria. También se observó una vejiga accesoria, estructuralmente disnta de la primaria y estrechamente asociada con un absceso inﬁltravo. Cerca de esta vejiga accesoria, se idenﬁcaron un tesculo pequeño y una estructura similar a una ovotess. Un examen más detallado reveló una estructura tubular extendida (marcada como “U” en la FIG. 2) que conectaba la vejiga accesoria con la región uretral. La ausencia de un oriﬁcio prepucial y de glándula prostáca, junto con la presencia de estas estructuras reproducvas mixtas, respalda el diagnósco de un fenopo intersexual, consistente con casos previamente documentados de trastornos del desarrollo sexual XX [14]. Los análisis histológicos respaldaron los hallazgos clínicos y de necropsia, proporcionando una caracterización detallada de las estructuras reproducvas. El remanente uterino vesgial presentó un endometrio glandular, lámina propia con glándulas endometriales y una capa muscular miometrial circular (FIG. 3C). Además, se idenﬁcó un canal sugesvo de una estructura vaginal conectada a la uretra peneana; no se detectó tejido prostáco durante la disección urogenital. FIGURA 1. Vistas ventral y perineal del cerdo que muestran: (a) una protuberancia en la región abdominal que puede representar un pliegue prepucial vesgial, (b) un tesculo atroﬁado dentro de una bolsa escrotal subdesarrollada, y (c) un pene rudimentario encerrado en un falso prepucio FIGURA 2. Hallazgos de necropsia en un cerdo con genitales ambiguos. (RP) Prepucio vesgial sin oriﬁcio prepucial y pene rudimentario (6 cm) con uretra estrecha. (AB) Vejiga accesoria adyacente a la vejiga urinaria primaria (PB), con dos riñones normales (LK, RK) y un uréter cada uno. Pequeño tesculo cerca de la vejiga accesoria (IT) y una estructura parecida a un ovario/tesculo (OT). Un canal que sugiere una vagina (U) conectada a la uretra peneana La hipoplasia tescular se evidenció mediante túbulos seminíferos con escasa acvidad espermatogénica y abundantes células de Leydig, lo que sugiere producción androgénica en un contexto de diferenciación gonadal incompleta (FIG. 3A). Los conductos epididimarios, aunque con arquitectura normal y epitelio seudoestraﬁcado con estereocilios, carecían de 3 of 6

Revista Cienﬁca, FCV-LUZ / Vol. XXXV UNIVERSIDAD DEL ZULIA Serbiluz Sistema de Servicios Bibliotecarios y de Información Biblioteca Digital Repositorio Académico espermatozoides maduros, indicando una disfunción tescular (FIG. 3B). Por otro lado, la histología renal mostró glomérulos bien deﬁnidos y túbulos con morfología conservada, sugiriendo una función renal preservada a pesar de las anomalías reproducvas (FIG. 3D). FIGURA 3. Cortes histológicos de: tesculo mostrando túbulos seminíferos con marcada hipoplasia de gonocitos, ausencia de procesos de espermatogénesis, abundantes células intersciales y túnica albugínea con septos (A); sección transversal de epidídimo mostrando conductos con epitelio pseudoestraﬁcado, estereocilios apicales, estroma de tejido conecvo y músculo liso (B); corte del útero mostrando el endometrio glandular, la lámina propia con glándulas endometriales y el miometrio con capa muscular circular (C); corte histológico sagital de un riñón donde se idenﬁca el glomérulo renal rodeado por un epitelio plano simple, adyacente a esta estructura se idenﬁcan túbulos renales formados por un epitelio cúbico simple (D) El perﬁl hormonal, reveló niveles de testosterona de 3,13 ng/ mL, compables con una acvidad androgénica pica de machos XY, a pesar de que el individuo presentaba un cariopo 2n = 36 + XX Este hallazgo indica producción acva de andrógenos, aunque la fuente exacta sigue siendo incierta debido al limitado desarrollo tescular observado histológicamente. Los niveles de estradiol (10,68 pg/mL) fueron inferiores a los esperados para un individuo con cariopo 2n = 36 + XX, lo que sugiere una reducción en la acvidad de la aromatasa y alteraciones en las vías de biosíntesis de estrógenos, similares a los patrones observados en casos de 2n = 36 + XX DSD asociados con hiperplasia suprarrenal congénita (HSC) en humanos [15]. Los niveles de progesterona (3,78 ng/mL) se encontraron dentro de los valores basales picos de cerdos no reproducvos. En conjunto, estos perﬁles hormonales respaldan una diferenciación gonadal acva pero aberrante e implican posibles alteraciones genécas o epigenécas previamente asociadas con la condición 2n = 36 + XX DSD [9 , 15]. Las observaciones histológicas corroboraron los hallazgos endocrinos, evidenciando túbulos seminíferos hipoplásicos sin espermatogénesis y una hiperplasia prominente de células de Leydig, lo que indica una diferenciación gonadal defectuosa (FIG. 3A). Estos hallazgos son consistentes con lo reportado por Kurtz et al. [15]. Los análisis citogenécos mediante nción de Giemsa y bandeo G conﬁrmaron un complemento cromosómico diploide de 38 cromosomas con una constución 2n = 36 + XX, esperada en hembras de Sus scrofa domesca (FIG. 4). Los cromosomas mostraron una estructura normal sin anomalías numéricas detectables, mosaicismo, quimerismo ni reordenamientos cromosómicos evidentes. Estos resultados citogenécos sugieren la posible parcipación de mecanismos genécos o epigenécos alternavos en la diferenciación tescular. Sin embargo, la translocación crípca del gen SRY no puede ser conﬁrmada ni descartada sin el uso de herramientas moleculares especíﬁcas. Informes previos han señalado que la diferenciación tescular en individuos con cariopo 2n = 36 + XX puede ocurrir mediante translocaciones crípcas de SRY o a través de genes autosómicos como SOX9, RSPO1 y WNT4, además de modiﬁcaciones epigenécas [5 , 16]. FIGURA 4. Cariopo con nción de Giemsa (A) y bandeo G (B) La diferenciación sexual en mamíferos, incluidos los cerdos, está determinada por la constución cromosómica (XX o XY) y la presencia o ausencia del gen SRY, el cual inicia el desarrollo tescular y la expresión del fenopo masculino. En ausencia de SRY, ocurre la diferenciación ovárica, dando lugar al desarrollo de un fenopo femenino [1 , 7 , 17]. Sin embargo, los Trastornos del Desarrollo Sexual XX caracterizados por un cariopo 2n = 36 + XX desaan este modelo binario, presentando disntos grados de masculinización a pesar de la ausencia del gen SRY. Se han implicado varios mecanismos en estas anomalías, incluyendo la translocación del SRY, mosaicismo, quimerismo y mutaciones autosómicas [2 , 3]. Estudios recientes han demostrado que la disrupción funcional o la ausencia de SRY pueden inducir la reversión sexual de macho a hembra, lo que resalta el papel críco de SRY y sus vías reguladoras en la diferenciación sexual [18]. El XX DSD presenta una alta prevalencia en cerdos, con frecuencias que oscilan entre 0.08% y 0.75% en la mayoría de las poblaciones, llegando al 20% en líneas endogámicas [7]. Su elevada heredabilidad, esmada entre 0,72 y 0,81, refuerza su origen genéco [10]. Las evaluaciones citogenécas suelen revelar un cariopo 2n = 36 + XX sin anomalías estructurales, lo que sugiere que factores no cariopicos, como mutaciones autosómicas o alteraciones epigenécas, desempeñan un papel crucial en estas condiciones [19 , 20]. Dada esta complejidad, la aplicación de herramientas moleculares avanzadas, como estudios de asociación del genoma completo (GWAS) y análisis transcriptómicos, son escenciales para idenﬁcar los factores genécos y epigenécos que contribuyen al 2n = 36 + XX DSD. Además de la translocación de SRY, se han idenﬁcado mecanismos genécos alternavos capaces de inducir la 4 of 6

Caracterización fenopica de un cerdo con cariopo XX / Apolo y cols. UNIVERSIDAD DEL ZULIA Serbiluz Sistema de Servicios Bibliotecarios y de Información Biblioteca Digital Repositorio Académico diferenciación tescular en individuos 2n = 36 + XX. Ferrari et al. [9] revisaron diversas alteraciones genécas y regulaciones transcripcionales que pueden favorecer este proceso en ausencia de SRY, incluyendo duplicaciones en SOX9, mutaciones en RSPO1 y WNT4, así como modiﬁcaciones epigenécas en genes clave del desarrollo gonadal. Aunque el análisis citogenéco no reveló anomalías estructurales en el presente caso, la ausencia de estudios moleculares detallados impide descartar la implicación de estos factores. El individuo analizado presentó genitales ambiguos y un cariopo 2n = 36 + XX sin indicios de mosaicismo, quimerismo o alteraciones cromosómicas evidentes. Aunque la translocación de SRY sigue siendo una posibilidad, la falta de detección de secuencias del cromosoma Y resalta las limitaciones de los métodos citogenécos convencionales, como la nción de Giemsa y el bandeo G, que no permiten idenﬁcar reordenamientos sules [5]. En este contexto, herramientas avanzadas de citogenéca molecular, como la hibridación in situ ﬂuorescente (FISH) y la hibridación genómica comparava (CGH), resultan esenciales para detectar translocaciones crípcas o micro-reordenamientos que podrían explicar el fenopo observado. CONCLUSIÓN Este estudio describe un caso de trastorno del desarrollo sexual XX DSD en un cerdo con genitales ambiguos, cariopo 2n = 36 + XX y estructuras reproducvas mixtas, sin evidencia de alteraciones cromosómicas visibles, lo que sugiere la posible implicación de mecanismos genécos o epigenécos no detectables mediante citogenéca convencional. La integración de los hallazgos clínicos, histológicos, hormonales y citogenécos revelan una diferenciación gonadal apica posiblemente asociada a la translocación crípca del gen SRY o a alteraciones en genes como SOX9, RSPO1 o WNT4. Este caso destaca la importancia de aplicar herramientas moleculares avanzadas en el diagnósco de intersexualidad animal y subraya las implicaciones producvas de estas anomalías en la industria porcina, parcularmente en lo relavo a la ferlidad. La detección temprana de individuos con DSD permiría opmizar las estrategias de manejo genéco y reducir las pérdidas económicas asociadas a estas condiciones en sistemas de producción comercial. Conﬂicto de Intereses Los autores conﬁrman que no enen ningún conﬂicto de intereses. AGRADECIMIENTOS Agradecemos el apoyo instucional que permió la realización de esta invesgación a través del proyecto (2024/ UTMACH-PR-GEN-278), respaldado por la Universidad Técnica de Machala. 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