Invest Clin 61(4): 335 - 348, 2020 https://doi.org/10.22209/IC.v61n4a04

Polimorfismo -308 del gen TNFa y su expresión local en lesiones preinvasivas

y cáncer de cuello uterino en el estado Zulia, Venezuela.

Eilyn Carolina Castro Barrios1, Tatiana Pardo Govea1, Yenddy Carrero Castillo1,

José Miguel Quintero Ferrer1, Yanira Sánchez Caridad1, Raúl Enrique Posada Bonilla2, Mercedes Fernández Mestre3 y Freddy Alaña Piña4

1Laboratorio de Genética Molecular, Instituto de Investigaciones Genéticas, Facultad de Medicina, LUZ. Maracaibo, Venezuela.

2Universidad del Zulia, Facultad de Medicina, Posgrado de Medicina Interna. Hospital General del Sur “Dr. Pedro Iturbe”. Maracaibo, Venezuela.

3Laboratorio de Fisiopatología, Instituto de Medicina Experimental, IVIC. Caracas, Venezuela.

4Servicios Médicos Odontológicos de la Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela.

Palabras clave: cáncer de cuello uterino; TNFα; polimorfismo -308 del gen TNFα;

neoplasia intraepitelial cervical.

Resumen. El Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNFα), es una citocina proinfla- matoria; su expresión es regulada a nivel transcripcional y se han asociado algunos polimorfismos con la progresión de cáncer de cuello uterino (CCU). El objetivo de este estudio fue caracterizar el polimorfismo -308 del gen TNFa y su expresión local en lesiones preinvasivas y CCU. Se analizaron muestras de ADN de sangre periféri- ca y biopsias de cuello uterino de 8 mujeres sanas y 33 con lesiones cervicales; el ADN se genotipificó mediante PCR-RFLP, empleando enzimas de restricción (NcoI) y, para su expresión en tejidos, se utilizó marcaje inmunohistoquímico. El polimor- fismo -308 del gen TNFa se encontró en Equilibrio de Hardy-Weimberg tanto en casos como en controles. El genotipo más frecuente fue el A/A (60,6%), mientras el genotipo A/G representó el 39,4% del total de pacientes con lesión y no se detec- tó genotipo G/G; así mismo, se encontró con mayor frecuencia el alelo A, 80,3%, mientras que el alelo G presentó una frecuencia del 19,7%. La expresión de TNFα por número de células positivas en tejidos fue heterogénea, observándose diferen- cias estadísticamente significativas entre el grupo inflamatorio y NIC II (p<0,045). No existe asociación estadísticamente significativa entre el alelo A del polimorfismo

-308 del gen TNFa (OR= 1,53; p = 0,585) con el CCU, así como entre el genotipo A/A y el CCU, pero para aclarar su papel en la carcinogénesis se necesitan realizar más estudios cuyo tamaño de la muestra sea mayor.

Autor de correspondencia: Eilyn C. Castro B. Instituto de Investigaciones Genéticas. Facultad de Medicina. Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela. Teléfonos: 0412-7682707/0424-6446103. Correo electrónico: eilyncastrob@gmail.com

Polymorphism -308 of TNFa gene and its local expression in preinvasive lesions and cervical cancer in Zulia state, Venezuela.

Invest Clin 2020; 61 (4): 335-348

Key words: cervical cancer; TNFa; -308 polymorphism of TNFa gene; cervical intraepithelial neoplasia.

Abstract: Cervical cancer (CC) is a public health problem worldwide, and it represents the first cause of mortality in Venezuelan women between 25 to 44 years of age. The tumor necrosis factor alpha (TNFα) is a proinflammatory cyto- kine. Its expression is at the transcriptional level and some polymorphisms have been associated with the progression of some types of cancer, among these, the CC. The objective of the present study was to characterize the -308 poly- morphism of the TNFa gene and its local expression in preinvasive lesions and CC. Peripheral blood DNA samples and cervical biopsies from 8 healthy women and 33 with cervical lesions were analyzed, DNA was genotyped by PCR-RFLP using restriction enzymes (NcoI), and immunohistochemical labeling was used for its expression in tissues. The -308 polymorphism of the TNF-a gene was found in Hardy-Weimberg equilibrium for both, individuals and lesions, as well as for healthy individuals. It was found that the most frequent genotype was AA (60.6%), while the genotype A/G accounted for 39.4% of the total patients with lesion and no G/G genotype was detected. TNF expression is by cellular cells in heterogeneous tissues, statistically significant differences were observed be- tween the inflammatory group and CIN II (p <0.045). The results reveal an as- sociation between the A allele of the -308 polymorphism of the TNFa gene and the development of preinvasive lesions, with an OR = 1.538, with a confidence interval of 95% ranging from 0.32-7.26 with a p = 0.58.

Recibido: 25-06-2020 Aceptado: 28-11-20200

INTRODUCCIÓN

El cáncer de cuello uterino constituye un problema de salud pública mundial (1). El carcinoma de células escamosas de cue- llo uterino es una de las neoplasias malignas más comunes en el sistema reproductor fe- menino (2), reportándose cerca de 570.000 nuevos casos de CCU y más de 311.000 muertes cada año (3). En 2019, hubo 13.170 nuevos casos de CCU y 4.250 nuevas muer- tes en Estados Unidos, según las estadísti-

cas de cáncer (4). En Latinoamérica repre- senta la tercera causa de muerte por cáncer (5), mientras que en Venezuela el cáncer de cuello uterino ocupa unos de los primeros lugares de mortalidad por cáncer en el gé- nero femenino, reportándose 1.387 muertes para el año 2013 (6) e incrementándose a

1.563 para el año 2014 (7). En el estado Zu- lia, se reportaron 206 muertes durante el año 2014, cifra que representa el 13,1% del total de muertes por esta causa, siendo el es- tado con la mayor tasa de mortalidad regis-

trada con respecto al resto del país (7). La incidencia de esta patología se ha asociado a diversos factores de riesgo que predispo- nen a las mujeres al desarrollo de este tipo de cáncer (1), tales como edad temprana de la primera relación sexual, múltiples com- pañeros sexuales, edad temprana del primer embarazo, compañeros sexuales promiscuos, bajo estado socioeconómico, infecciones va- ginales y cervicales, infección por el virus del papiloma humano (VPH), herpes genital (VHS), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), inmunosupresión, prostitución, hábi- to tabáquico, anticonceptivos orales (ACO), enfermedades de transmisión sexual (ETS), entre otros (1). La presencia de estos facto- res, puede condicionar la aparición de la en- fermedad, la cual puede manifestarse con la presencia de lesiones displásicas a nivel del cuello uterino en diferentes grados y evolu- cionar o no a una lesión maligna e invasiva (1). Aunque, los hallazgos señalan el VPH como un factor de riesgo importante (3), no es causa suficiente para malignidad, ya que gran número de mujeres infectadas con el VPH nunca desarrollaron lesiones cervicales (8). Esto puede sugerir la implicación de los antecedentes genéticos en la transformación maligna de células epiteliales a cáncer de cuello uterino (9). La respuesta inmunitaria a nivel del cuello uterino es compleja, prin- cipalmente debido a su participación en los eventos reproductivos. La producción in situ de citocinas reviste mayor importancia que la sistémica y puede determinar diferentes efectos; así ha observado que, de acuerdo al perfil de citocinas, es posible obtener efectos proinflamatorios, inflamatorios y quimiotác- ticos (10). Esta respuesta local puede ser del tipo Th1, que incluye interleuquina 2 (IL -2), factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), e in- terferón gamma (IFN-γ); o de tipo Th2, con IL -4, IL -5, IL -6, IL -10, IL -13 (1).

El Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNFα) es una citocina importante en la res- puesta inflamatoria y en los mecanismos de defensa del individuo frente a infecciones

virales, bacterianas y parasitarias. El TNFα tiene efectos antitumorales por medio de tres diferentes mecanismos biológicos: la necrosis hemorrágica causada por la citoci- na a nivel del endotelio tumoral, el efecto inmunomodulador sobre las células inmuni- tarias efectoras y el efecto citotóxico directo mediado por esta citocina. Sin embargo, el TNFα puede también tener diferentes efec- tos, los cuales pueden promover el creci- miento, proliferación del tumor y la metás- tasis (11, 12).

Existen diversos estudios donde se muestra una asociación entre el TNFα y el desarrollo de tumores, específicamente en células epiteliales de cuello uterino, pero existen muy pocos estudios donde se eva- lúe una posible asociación entre los niveles de TNFα y el grado de lesión, reportándose que el TNFα se expresa en los queratinoci- tos basales de cuello uterino normal, y se expresa con elevados niveles en la neoplasia intraepitelial cervical (NIC) de bajo y alto grado, aún en ausencia de VPH (13, 14). La expresión de TNFα está regulada a nivel transcripcional; en particular, el polimorfis- mo -308 del gen TNFa que consiste en la sustitución de una base G por A en la po- sición -308 de la región promotora del gen TNFa (15), encontrándose que la presencia del alelo A, que es menos común, está aso- ciada con el incremento en los niveles de la citocina, mientras que el alelo G se asocia a una menor producción de la misma (16- 19). Algunos investigadores sugieren que el desarrollo de tumores puede estar relacio- nado a la predisposición genética del indi- viduo de producir mayores niveles de TNFα. Actualmente, existen estudios enfocados en los efectos de variaciones en la región promotora del gen TNFa y su relación con el cáncer de cuello uterino, encontrándose resultados contradictorios (9, 17, 20-23). Sin embargo, otros autores sugieren que la diferencia entre los niveles de producción de TNFα radica en la base genética de las poblaciones estudiadas (23, 24).

PACIENTES Y MÉTODOS

Se examinaron 300 mujeres que acudie- ron a la consulta ginecológica del Hospital “Noriega Trigo”, sede San Francisco, estado Zulia, Ambulatorio de San Jacinto y Servi- cios Médicos Odontológicos de la Universi- dad del Zulia, sede Maracaibo, estado Zulia, y solo 41 pacientes (n=41) fueron selec- cionadas intencionalmente, tomando como base los siguientes criterios de inclusión: que fueran mujeres nacidas en el estado Zulia, que por lo menos, uno de sus padres, tuviera el mismo lugar de nacimiento, y pre- sentaran alteración colposcópica con evi- dencia histológica de displasia en el epitelio cervical. Para el grupo control, los criterios de inclusión fueron: pacientes nacidas en la región zuliana, no presentar ningún grado de lesión intraepitelial en cuello uterino, ni tener antecedentes personales de lesión en cuello uterino. Criterios de exclusión: estar embarazada, estar bajo tratamiento inmuno- supresor, haber recibido tratamiento previo de las lesiones en cuello uterino, infección por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), estar en tratamiento hormonal, anti- inflamatorio o anti-infeccioso local y/o sis- témico por otras patologías genitales en los tres meses previos. A todas las pacientes se les realizó una historia clínica para recolec- tar datos sociodemográficos, personales, fa- miliares, epidemiológicos y clínicos. Así mis- mo, cada paciente firmó un consentimiento informado para participar en la investiga- ción aprobado por el Comité de Bioética de la Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia, cumpliendo con las normas de Helsin- ki de principios éticos para las investigacio- nes médicas en seres humanos.

En la Sección de Inmunogenética del Laboratorio de Genética Molecular del Ins- tituto de Investigaciones Genéticas de la Facultad de Medicina de La Universidad del Zulia, se colectó 5mL de sangre periférica, de cada paciente, anticoagulada con ácido etilendiamino tetracético (EDTA) 5mM pH 7,4, para la extracción del ADN genómico,

mediante la técnica combinada de extrac- ción de ADN a partir de las técnicas Fenol/ Sevag (25) e Inorgánica (26). Posteriormen- te, se evaluó la calidad e integridad del ADN de cada muestra, en un espectrofotómetro (Beckmam DU 7500) y también se confirmó a través de una electroforesis en gel de aga- rosa al 1%, en buffer TBE1X a 100 V, por un tiempo de 15 a 20 minutos, coloreando con bromuro de etidio y se observó en un tran- siluminador de UV, verificando así la presen- cia del ADN genómico. Una vez extraído el ADN y verificado su concentración, calidad e integridad, se realizó la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), para lo cual se utilizó enzimas de restricción (NcoI), para su geno- tipificación. Igualmente, se tomaron mues- tras de tejido de cuello uterino en los ser- vicios de ginecología, con personal médico calificado. Se tomaron dos muestras de biop- sia bajo colposcopia; una se fijó en formalina al 10% para el análisis anatomopatológico, siguiendo los criterios de Richard (27), y la otra se incluyó en el componente OCT (Tis- sue Tek, Miles Inc Diagnostic, Kankakee, IL, USA) y se congelaron en hielo seco y ace- tona (a -70°C) para determinar la expresión de TNFα a nivel celular mediante pruebas de inmunofluorescencia. De las biopsias conge- ladas incluidas en Tissue Tek (componente OCT) se realizaron cortes de 4μm por cada tejido, utilizando un criostato Shandon™ (ThermoScientific™). Posteriormente se fi- jaron con acetona fría durante 5 minutos y se lavaron por 2 minutos con buffer fosfato salino (PBS) pH 7,4, se incubaron durante una hora en cámara húmeda a 37°C con el anticuerpo monoclonal primario correspon- diente al TNF (TNF-α: (AS1) Santa Cruz Bio- technology, Inc) previa dilución 1:500 y se lavaron con PBS pH 7,4. Para la localización se empleó un segundo anticuerpo de unión a IgG kappa de ratón marcado con ficoeritrina (m-IgGκ BP-PE Santa Cruz Biotechnology, Inc) el cual se diluyó previamente 1:500 y se incubaron a 37°C durante media hora en cá- mara húmeda, y se lavaron con PBS transcu- rrido el tiempo de incubación. Para el control

de expresión se subcultivaron 10–6 células Hela (ATCC® CCL -2) por pozo en placas de 6 pocillos con medio DMEM, suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 μg/mL de penicilina y 100 U/mL de estreptomicina

cuantitativa (niveles de TNFα). Con base en esto se aplicó, en cuanto al manejo descripti- vo de los datos, medidas de tendencia central como la media y de dispersión como la Des- viación Standard. Los niveles de expresión de

2

a 37°C, 5% de CO

y atmósfera húmeda, por

TNFα en las muestras de tejido estudiadas se

24 horas sobre cover slip, seguidamente se fijaron con paraformaldehído 1% por 15 mi- nutos. Se empleó la técnica de inmunocito- química para el marcaje de TNFα, emplean- do el anticuerpo (TNF-α: (AS1) Santa Cruz Biotechnology, Inc) previa dilución 1:500. Para la localización se empleó un segundo anticuerpo de unión a IgG kappa de ratón marcado con ficoeritrina (m-IgGκ BP-Alexa 488® Santa Cruz Biotechnology, Inc) el cual se diluyó previamente 1:500 y se incubo a 37°C durante media hora en cámara húme- da, se lavó con PBS transcurrido el tiempo de incubación, posteriormente las células fueron montadas sobre portaobjetos con Aqueous Mounting (Ultra Cruz), para su vi- sualización se utilizó un microscopio de fluo- rescencia Leica-DMi8 (Leica Microsystems, Alemania). El control negativo estuvo repre- sentado por IgG de ratón del mismo isótopo al anticuerpo primario. Una vez realizadas las tinciones, las muestras se secaron en os- curidad y se permontaron con UltraCruz® Aqueous Mounting Medium with DAPI para evitar la pérdida de fluorescencia y se ob- servaron al microscopio con epifluorescen- cia Leica DMi8, empleando los filtros DAPI (358-461nm) y Texa Red (595- 615 nm) con una magnificación de 630X. Las imágenes microscópicas se capturaron en fotografías digitales a través del software Leica Applica- tion Suite (LAS) X que permite el análisis de imágenes, además de la cuantificación de la intensidad de la fluorescencia (positividad) por medio de un valor obtenido de la rela- ción de pixeles totales de la fotografía y los pixeles del área considerada como positiva.

Análisis Estadístico. Las técnicas utili- zadas para el análisis de los datos se aplicaron de acuerdo a las variables medidas: variables cualitativas (polimorfismo -308 del gen TNFa y grados de lesión de cuello uterino); variable

analizaron mediante el análisis de la varianza (ANOVA) y la relación del polimorfismo -308 del gen TNFa con la expresión del TNFα en te- jido de cuello uterino se llevó a cabo median- te la prueba t de Student para variables inde- pendientes, empleando el paquete estadístico SPSS 17.0 y Graphap prisma 7.0. La probable asociación entre el polimorfismo -308 del gen TNFa y los niveles de expresión se realizó a través de chi cuadrado y Odds Ratio (OR), con un intervalo de confianza (IC) del 95%, empleando el paquete estadístico SPSS 17.0. Las frecuencias alélicas y genotípicas obser- vadas se evaluaron según lo esperado bajo la hipótesis del equilibrio de Hardy-Weinberg, utilizando el programa de genética poblacio- nal Arlequin 3.11.

RESULTADOS

Se analizaron y procesaron 41 muestras de pacientes que cumplieron los criterios de inclusión para esta investigación y, de acuer- do a las características clínicas, se organiza- ron en cinco grupos según su diagnóstico, de las cuales el grupo NIC I fue el más prevalen- te, con un 36,6%, seguido de los grupos, NIC II y NIC III, con 17,1% en cada caso. El grupo conformado por pacientes con lesión inflama- toria a nivel de cuello uterino representó un 9,7% en la incidencia del total de casos. El grupo control represento el 19,5% (Tabla I).

El rango de edad de las pacientes parti- cipantes en este estudio fue de 18 a 61 años. Al agrupar la muestra de acuerdo al grupo etario, se observó que la mayoría de las par- ticipantes tenían entre 25 y 44 años de edad, siendo este grupo el más afectado, dato que coincide con las edades de mortalidad en cáncer de cuello uterino en nuestro país (8).

Al determinar las frecuencias alélicas y genotípicas en los grupos estudiados se

TABLA I

DISTRIBUCIÓN DE FRECUENCIAS SEGÚN EL NÚMERO DE CASOS PARA CADA GRUPO DE ESTUDIO.

observó que el alelo A fue el más frecuente, presente en los casos con lesión en un 80,3% del total de los casos con lesión (inflamato- ria, NIC I,NIC II, NIC III/Ca in situ), mien- tras que el alelo G, en un 19,7%, siendo el grupo NICI el que reportó mayor frecuencia del alelo A (39,4%), seguido del grupo NIC II (16,7%), NIC III/Ca in situ (15,1%) y el grupo inflamatorio (9,1%). Mientras que el alelo G, para los grupos de NIC I y NIC III, se observó en un 6,1% cada uno, NIC II el 4,2% y el grupo inflamatorio, 3% (Tabla II).

El genotipo más frecuente en los gru- pos con algún grado de lesión fue el A/A con un 60,6% y el A/G con un 39,4%, mien- tras que en el grupo control los genotipos A/A y A/G mostraron la misma frecuencia

(Tabla III). El genotipo G/G no se encon- tró en la muestra estudiada. Se registró mayor frecuencia del genotipo A/A en el grupo NIC I (33,3%), seguido del grupo NIC II (12,1%), NIC III/Ca in situ (9,1%)

y el grupo inflamatorio (6,1%). Mientras que el genotipo A/G, para NIC I y NIC III reportó 12,1% cada uno, NIC II el 9,1% y el grupo inflamatorio 6,1%.

Las distribuciones genotípicas obser- vadas en los grupos de estudio fueron con- cordantes con lo esperado bajo la hipótesis de equilibrio de Hardy-Weinberg p>0,05, no significativo. La población está en equilibrio de Hardy Weinberg, X2= 2,41, P= 0,11.

Para conocer una posible asociación entre el polimorfismo -308 del gen TNFα y el desarrollo de lesiones preinvasivas de cue- llo uterino, se formuló una tabla de contin- gencia X2=0,298. Al calcular el Odds Ratio, se obtuvo, OR=1,53 con un intervalo de confianza de 95% (0,32-7,26) y p=0,585. Aunque estos resultados no muestran dife- rencias estadísticamente significativas, pro- bablemente por el reducido tamaño de la muestra, al observar la estimación de riesgo (Odds Ratio-OR), las pacientes que poseen el alelo A del polimorfismo -308 del gen TNFα tienen 1,53 veces más probabilidad de desarrollar algún grado de lesión.

Al realizar el análisis inmunohistoquí- mico, para determinar la expresión de TNFα

TABLA II

FRECUENCIAS ALÉLICAS EN PACIENTES CON LESIONES INFLAMATORIAS, NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL Y PACIENTES CONTROL.

ALELO DIAGNÓSTICO

Sano Lesiones a Nivel Cervical control Inflamatorio NIC I NIC II

NIC III/

Ca in situ

Total (Lesiones)

NIC, Neoplasia Intraepitelial Cervical. Ca, carcinoma.

en las muestras de tejidos, se analizó tanto la intensidad de la expresión de la citocina como el número de células positivas para TNFα. Figs. 1, 2 y 3.

Las medidas descriptivas como la me- dia y desviación estándar en la cuantifica- ción del número de células positivas para la expresión de TNFα en tejidos de cuello ute- rino para cada grupo fueron: control (sano): 6,93 ± 2,81; inflamatorio: 10,85 ± 4,107;

NIC I: 8,35 ± 2,73; NIC II: 5,82 ± 1,92; NIC

III: 8,31 ± 1,75. En la Fig. 4, se observa la distribución de las medias en cada grupo.

Los resultados obtenidos en el análisis de la varianza (ANOVA) de la expresión de TNFα según el número de células positivas, se consideraron no significativos (P> 0,05= 0,05. Sin embargo, al aplicar el test de com- paración múltiple Bonferroni, se encontró diferencia significativa al comparar el grupo inflamatorio con el grupo NIC II, observán- dose una diferencia de medias de 5,02571 ± 1,65641 células por campo, y una p= 0,045, con un intervalo de confianza del 95%.

En la Fig. 5 se observan los resultados obtenidos al analizar la intensidad de la ex-

TABLA III

FRECUENCIAS GENOTÍPICAS EN PACIENTES CON ALGÚN GRADO DE LESIÓN Y EL GRUPO CONTROL.

Fig. 1. Las imágenes A y B muestran expresión de TNFα en células Hela (ATCC® CCL -2), las cuales se in- cluyeron como control positivo y C la magnificación (ROI) de la imagen B en el cual se evidencia la expresión del TNF empleando los anticuerpos TNFα: (AS1) y m-IgGκ BP marcado con Alexa Flúor®

488. Magnificación 630X.

Fig. 2. Expresión de TNFα en pacientes sanos y con endocervicitis crónica a través de análisis inmunohisto- químico. Las imágenes A y B muestran expresión de TNFα en tejidos procedentes de pacientes sanos, mientras que C y D en tejidos de pacientes con endocervicitis crónica. Las flechas señalan células positivas para TNFα empleando los anticuerpos. Magnificación 630X.

Fig. 3. Expresión de TNFα en tejidos con lesiones en cuello uterino a través de análisis inmunohistoquímico.

Las imágenes A y D muestran expresión de TNFα en tejidos procedentes de pacientes diagnosticados con NIC I, B y E pacientes con NICII, mientras que C y F pacientes diagnosticados con cáncer in situ. Las flechas señalan células positivas para TNFα empleando los anticuerpos TNF-α: (AS1) y m-IgGκ BP marcado con ficoeritrina. Magnificación 630X.

Fig. 4. Número de células TNFα positivas distribuidas de acuerdo al tipo de lesión y controles. NIC, neoplasia intraepitelial cervical. TNF, factor de necrosis tumoral.

Fig. 5 Intensidad por campo de la expresión de TNFα distribuidas de acuerdo al tipo de lesión y controles.

presión en el intersticio de TNFα por campo en las muestras de tejido de cuello uterino. Se determinaron las siguientes medias y des- viación estándar para cada grupo: control (sano): 410,835 ± 155,92; inflamatorio:

419,46 ± 254,66, NIC I, 466,35 ± 198,05, NIC II, 509,52 ± 198,05 y NIC III/Ca in situ

542,110 ± 126,65. Al realizar el análisis de la varianza no se encontró diferencias signi- ficativas entre los pacientes con algún grado

de lesión en cuello uterino y los pacientes sanos, ya que el valor de p fue mayor de 0,05. Sin embargo, se puede observar que el nivel de intensidad en la expresión de la citocina va aumentando de acuerdo la inflamación progresa a algún grado de Neoplasia Intrae- pitelial Cervical.

Al evaluar la posible asociación entre el polimorfismo -308 y la expresión de TNFα en los tejidos, a través de la prueba t de Stu-

dent para muestras independientes, no se encontraron diferencias significativas en el recuento de células positivas para la citoci- na, y tampoco al contrastar los resultados con la intensidad del intersticio por campo. Por lo tanto, el número de células positivas por campo como la intensidad del intersticio que muestran la expresión de TNFα, son indepen- dientes del genotipo por lo que se establece que no hay asociación entre estas variables.

DISCUSIÓN

El cáncer de cuello uterino (CCU) re- presenta un problema de salud pública mun- dial, debido a su alta prevalencia y alta tasa de mortalidad. En Venezuela, es la primera causa de muerte para el género femenino en edades entre 25-64 años de edad (7). Los resultados de morbilidad observados son si- milares ya que las pacientes que presentaron enfermedad inflamatoria o algún grado de neoplasia intraepitelial cervical se encontra- ban en este grupo etario. Se ha sugerido que la presencia del polimorfismo -308 del gen TNF-a puede influir en la gravedad de varias enfermedades y asociarse con la aparición de cáncer de cuello uterino, pero los resultados no han sido concluyentes hasta el momento (24). En este estudio se analizaron las fre- cuencias alélicas y genotípicas de 41 pacien- tes para determinar su asociación con el de- sarrollo de lesiones preinvasivas y cáncer de cuello uterino. No se encontraron estudios en donde se evaluara la relación genotipo con la expresión génica en tejido de cuello uterino con o sin algún grado de lesión, por lo que los resultados del presente estudio se compararon con estudios poblacionales en donde se investigó el polimorfismo -308 del gen TNF-α en diversas poblaciones caucási- cas, mestizas, asiáticas, entre otros.

El genotipo A/A, ha sido asociado con mayor riesgo a desarrollar distintas enferme- dades y diferentes tipos de cáncer, según lo reportado para otras poblaciones del mundo (28). En este estudio, se encontró presente en un 58,5%, mientras que el genotipo he-

terocigoto A/G se detectó en un 41,5% y el genotipo G/G no se evidenció en ninguna muestra. Estos resultados demuestran que del total de casos con lesión a nivel de cue- llo uterino, el alelo A fue el más frecuente al analizar los resultados en los grupos con algún grado de lesión (80,3%), frente al ale- lo G (19,7%), contrario a lo estudiado por Acosta y col. en poblaciones mestizas y de origen caucásico del Perú (28), en donde es- tudiaron 135 individuos utilizando la técnica PCR RFLP encontrando que la presencia del alelo A es el alelo menos frecuente (12,5%) en mestizos y ausente en caucásicos, el ge- notipo A/G se detectó en 5,2% en mestizos de Lima y Loreto, siendo el genotipo G/G el más frecuente con un 87,5%.

En el estudio realizado por Barbisan y col. (29), en una muestra de 122 pacien- tes y 176 controles de La Plata, Argentina, determinaron el polimorfismo -308 del gen TNF-α de muestras de ADN, a través de la técnica de PCR RFLP, pero no encontraron asociación entre genotipos del polimorfismo estudiado y el riesgo a desarrollar cáncer de cuello uterino, lo que concuerda con los re- sultados del presente estudio. Sin embargo, encontraron la presencia del genotipo A/G en un 32% de los casos (29).

Rotar y col. (30), analizaron la relación entre el polimorfismo – 308 de gen TNFa y NIC, en pacientes del condado Cluj-Napocaen en Rumania. Se estudiaron muestras de ADN de 78 casos de NIC y 107 controles mediante PCR-RFLP, y en todas las clases de neoplasia intraepitelial cervical, el genotipo G/G fue el que se encontró con mayor frecuencia; sin embargo, contrario a nuestros resultados, el genotipo A/A fue extremadamente raro en la población de estudio, pero sus datos sugie- ren una asociación entre la presencia de un alelo A y cáncer invasivo (OR = 10,8261, IC del 95% = 1.0748-109.0511, p = 0.0433).

Estudios en otras poblaciones como el de Haoshan y col. (31), analizaron la relación entre el TNFα -308 G>A, -238 G>A, y TN-

FRII-VNTR -322 y el cáncer cervical en 240 pacientes de Han, China, con cáncer cervical

invasivo y 220 pacientes sanos (control). La genotipificación del polimorfismo -308 del gen TNFa se realizó mediante PCR-RFLP. El análisis estratificado de FIGO mostró que la variante menor A/A y el G/A + A/A com- binado de TNFα-238 G>A y TNFα-308 G>A aumentaron el riesgo de evolución tumoral, (P=0,011, OR=2,91, IC del 95%=1,11-7,79; P=0,005, OR=2,79, IC del 95%=1,28-6,81;

P=0,001, OR=15,33, respectivamente); ob- servándose una asociación estadísticamente significativa entre el polimorfismo del TNFα y la progresión clínica del cáncer según la clasificación de la FIGO. Estos resultados su- gieren un incremento en el riesgo para cán- cer cervical en pacientes con genotipo A/A y A/G (31).

Li y col. (32) correlacionaron el poli- morfismo de TNF-α-308 y la susceptibilidad al cáncer de cuello uterino en 142 pacientes con cáncer de cuello uterino y 150 controles sanos, utilizando PCR-RFLP y enzima de res- tricción NCoI. Al igual que nuestros resulta- dos, no encontraron diferencias significati- vas en las frecuencias genotípicas y alélicas entre el grupo de pacientes con cáncer de cuello uterino y el grupo control; sin embar- go, observaron que el genotipo A/A pudiera estar asociado con el incremento del riesgo de desarrollar cáncer de cuello uterino en 1,46 veces, con un intervalo de confianza del 95% de 0,32 a 6,67. Además, encontraron que pacientes con el alelo A tuvieron cáncer cervical de alto grado de malignidad (32).

Li y col. (32), también correlaciona- ron 5 polimorfismos en la región promo- tora del gen TNFα (rs361525, rs1800629, rs1800750, rs1799964, and rs673) con la susceptibilidad a desarrollar cáncer de cuello uterino, en 946 muestras de sangre periférica de mujeres de la etnia Han de la provincia de Shandong, de las cuales 452 fueron diagnosticadas con carcinoma cer- vical de células escamosas y 492 pacientes controles. Las muestras fueron analizadas empleando PCR SNP`s utilizando el méto- do de la sonda TaqMan. Estos resultados de Li y col. (32) están en contradicción con

los obtenidos en el presente estudio donde hubo diferencias estadísticamente significa- tivas entre los grupos de casos y controles para el polimorfismo rs1800629 (P<0,001) que tuvo una correlación significativa con CCU. La frecuencia del alelo A para el poli- morfismo rs1800629 fue significativamente elevada para el cáncer cervical (29,9%) con respecto al grupo control (14,2%; OR=2,58, IC 95% = 1,87-3,56, P<0,01). Los polimor-

fismos rs361525, rs1800629, y rs17999645 se correlacionaron significativamente con el diagnóstico de cáncer cervical (9).

Du y col. (33), investigaron la distribu- ción de SNP de TNF (−238 G/A, −308 G/A) e IL10 (−592 C/G, −819 C/T y −1082 G/A)

y su relación con el cáncer de cuello uterino en una gran cohorte de mujeres chinas. En sus resultados reportaron para el polimorfis- mo −308, una mayor frecuencia genotípica para A/A en pacientes con cáncer de cuello uterino que en controles. En ese trabajo se encontró asociación estadísticamente signi- ficativa entre los genotipos A/A del polimor- fismo TNF-308 y los genotipos C/A o A/A de la IL10-592 y las pacientes con cáncer cervi- cal (p <0,0167). Además, encontraron que la combinación de las variantes G/A del poli- morfismo TNFα -308 con la variante C/A de la IL10-592 y la combinación G/G o G/A del polimorfismo TNFα-308 con la variante C/A o A/A de la IL10, tuvieron una asociación con la severidad del cáncer cervical cuando es- tán juntos. Estos resultados sugieren que los genotipos A/A del polimorfismo TNFα-308 y CA/AA de la IL10-592 CA/AA pueden incre- mentar la susceptibilidad para desarrollar el cáncer cervical a través de la alteración de la respuesta inmunitaria de un individuo (33). Aunque nuestros resultados no fueron es- tadísticamente significativos, encontramos que el genotipo A/A presentó una frecuencia del 60,6% en pacientes con algún grado de lesión a nivel de cuello uterino.

Al determinar la asociación de la expre- sión de TNFα en tejidos con el genotipo, no hubo diferencias significativas; sin embargo, al cuantificar la intensidad por campo de la

expresión de TNFα en las muestras de tejido de cuello uterino, se observó que ésta se in- crementaba gradualmente desde el proceso inflamatorio a NIC I, II y III/Ca in situ para la población de estudio. Tales resultados también son contradictorios a los hallazgos reportados por Pardo en el 2005 (1) en pa- cientes de San Francisco, estado Zulia-Vene- zuela, donde no encontraron diferencias sig- nificativas a medida que aumenta el grado de lesión al observar el número de células positivas para TNFα mediante estudio de in- munofluorescencia indirecta en cortes de tejido cervical; sin embargo, al comparar la expresión de TNFα en cada uno de los gru- pos de lesión, con respecto al grupo control, se observó diferencias significativas con los estadios NIC I y NIC III (p<0,008) (1). Otro estudio similar, donde se observó el núme- ro de células positivas para TNFα mediante estudio de inmunofluorescencia indirecta en cortes de tejido cervical, fue el de Callejas- Monsalve en el 2011 (34), en pacientes de Maracaibo y San Francisco, estado Zulia, Ve- nezuela, el cual también mostró resultados contrarios a los obtenidos en este estudio, con diferencias significativas con los esta- dios NIC I y NIC III al compararlos con los grupos control (p<0,05), mientras que en nuestro estudio se observó diferencias signi- ficativas al comparar el grupo inflamatorio con NIC II (p<0,045).

El análisis estadístico del presente es- tudio demostró que no existe asociación sig- nificativa entre el alelo A del polimorfismo

-308 del gen TNFα con el CCU (OR=1,53; p=0,585), así como entre el genotipo A/A y el CCU, probablemente por el reducido número de la muestra. Sin embargo, cabe destacar que el alelo A fue el más frecuente (80,3%) frente al alelo G (19,7%), y pudie- ra esto representar un factor de riesgo para las pacientes que participaron en el estudio, por lo que se recomienda realizar nuevos estudios donde se amplíe el tamaño de la muestra y, de esta manera, obtener mayor información que permita comprender mejor la distribución alélica y genotípica del poli-

morfismo -308 del gen TNFα y su relación con la predisposición al desarrollo y/o evolu- ción de las lesiones preinvasivas a cáncer de cuello uterino.

Este estudio es inédito en el estado Zulia y Venezuela, puesto que no solo se considera- ron los polimorfismos, sino también su expre- sión en el tejido del cuello uterino. Si bien no arrojó datos concluyentes, permitió dilucidar el papel de este factor genético en el proceso de carcinogénesis y en los procesos inflamato- rios que pudiesen preceder a la lesión.

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