Optimización de un método de preparación de ADN a partir de muestras de esputo para la detección por la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) de Mycobacterium tuberculosis
Abstract
En este estudio optimizamos un procedimiento casero para la preparación y extracción del ADN de micobacterias en esputos para el diagnóstico por la RCP de la tuberculosis pulmonar. Inicialmente se utilizaron 14 esputos (BK+++) para evaluar la actividad fluidificante de 5 sustancias: N-acetil-L-cisteína (NALC) 30mM-Hidróxido de sodio (NaOH) al 4%, NALC 30 mM, NaOH al 4%, Cloruro de cetilpiridinium (CPC) del 1% al 3%-Cloruro de sodio (NaCl) al 2% e Hipoclorito de sodio (NaOCl) al 4,5%. Las muestras fluidificadas se sometieron a la acción independiente de la lisozima o el tritón X-100 conjuntamente con estrés térmico. La extracción del ADN se confirmó mediante la detección de la secuencia de inserción IS6110 de M. tuberculosis por la RCP. De las sustancias fluidificantes probadas, el NaOCl al 4,5% produjo una fluidificación rápida del esputo. El tratamiento posterior de la muestra con lisozima y los cambios térmicos permitieron evidenciar la amplificación de la secuencia IS6110. El valor diagnóstico de esta optimización se evaluó en 30 esputos positivos para M. tuberculosis por baciloscopía y cultivo. Los resultados demostraron que en el 66,67% de las muestras se logró detectar la secuencia IS6110 y en el 33,33% de las muestras restantes con baja carga bacteriana (8, BK++ y 2, BK+), la secuencia IS6110 se detectó luego de diluir el ADN o agregar albúmina sérica bovina acetilada a la mezcla de amplificación. La metodología propuesta tiene una limitada sensibilidad, pero puede aumentarse diluyendo el ADN o adicionando sustancias que reviertan los inhibidores de la RCP. Este es el primer trabajo donde se utiliza el NaOCl al 4,5%, como sustancia fluidificante para la preparación de esputos que serán utilizados en el diagnóstico de tuberculosis pulmonar mediante la RCP.
