Utilización de una fase micelar para la inyección directa de muestras de plasma humano en la determinación de vitaminas K1 y menaquinona-4 por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa con detección por fluorescencia
Abstract
En el presente trabajo se empleó una precolumna LiChrospher RP-18 ADS (alquil diol sílica) inserta en un sistema de columnas acopladas bajo la modalidad de transferencia indirecta reversa como etapa de tratamiento en línea para la determinación de vitaminas K1 y MK-4 por CLAR con detección por fluorescencia. Las muestras de plasma humano se inyectaban directamente en la precolumna con una fase de extracción constituida por 2-propanol/acetonitrilo 200 mM dodecilsulfato de sodio en buffer fosfato 10mM pH= 7,4 (20:25:55, v:v:v). La separación se realizó en una columna Novapack C18 (150 mm x 3,9 mm d.i. y 4 µm d.p.) utilizando como fase móvil A: agua/acetonitrilo (80:20, v/v) y como fase móvil B: metanol/acetonitrilo (65:35, v/v) en régimen de gradiente de elución a un flujo de 0,8 mL/min. Las vitaminas K1 y MK-4 se redujeron en línea en una columna de zinc metálico y el producto se detectó por fluorescencia. La validación del método indicó linealidad entre 0,2 ”“ 1,6 ng/mL, con un límite de cuantificación de 0,2 ng/mL para ambas vitaminas. La recuperación para todos los casos estuvo comprendida entre 90,5 y 112,0% con un C.V. <3,8%. Finalmente, el método propuesto se utilizó para analizar muestras de plasma de individuos sanos con una frecuencia de análisis de 4 muestras/hora.
